背景:视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是最具代表性的视网膜变性疾病,其特征是色素上皮发生结构和功能异常,引起视网膜光感受器细胞的凋亡及坏死。主要表现为视网膜色素上皮吞噬功能障碍和神经细胞进行性凋亡,以夜盲、进行性视野缺损、视网膜色素沉着、视盘蜡黄色萎缩等为主要临床特征,最终导致失明。N-甲基-N-亚硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea,MNU)作为一种烷基化致癌物,可通过选择性损伤视网膜感光细胞,导致细胞死亡,诱发RP,并在RP研究中得到了广泛的应用。RP患者感光细胞凋亡,视网膜炎症因子上调,因此抗炎、抗凋亡是治疗RP的主要靶点。现阶段,RP主要治疗方法包括基因治疗,干细胞治疗和药物干预。但是RP遗传方式复杂,等位基因过多,干细胞移植尚存在难解决的技术问题,使得基因治疗和干细胞治疗应用受限。因此,通过药物筛选,寻找治疗RP的药物将可能成为一种有效的途径,尤其是中药治疗是一种重要的可能方式,并得到广泛重视。决明子以其有明目之功而名之,是中医眼科治疗眼疾的重要药物,有研究表明,决明子具有抗凋亡、抗炎和抗氧化等的药理作用。决明子多糖(Semen cassiae polysaccharide,SCP)是从决明子中提取的水溶性多糖,是其主要活性成分之一,也是发挥明目作用的主要成分,可用于治疗白内障、视网膜炎、视神经萎缩、青光眼、结膜炎等眼病,但对RP的治疗作用及其机制尚未得到研究。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)是一种脂类激酶,具有磷脂酰肌醇激酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的双重活性。AKT又称为蛋白激酶B(PKB),是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是PI3K下游典型的活性分子,可促进视锥细胞的增殖。研究发现,PI3K/Akt信号通路在多种眼科疾病的发生发展发挥重要作用,可抑制细胞凋亡,诱导细胞增殖,达到细胞保护作用。Toll样受体(TLRs)在炎症反应中起着重要的调节作用,TLR4水平升高可诱导炎性细胞因子,包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)等。核转录因子kappa B(NF-κB)是一种与视网膜炎症反应相关的促炎症转录因子,TLR4受体激活后可通过信导激活NF-κB,发挥抗炎免疫调节的作用。因此,决明子水溶性多糖很可能通过调控PI3K/Akt和TLR4/NF-κB信号通路对MNU诱导的的大鼠RP发挥抗凋亡抗炎作用,进而对RP起到治疗和保护作用。目的:1.探讨决明子水溶性多糖对大鼠RP的抗凋亡和抗炎作用,寻找并证实决明子水溶性多糖对RP具有保护作用。2.探讨决明子水溶性多糖治疗大鼠RP的抗凋亡和抗炎的可能机制。验证决明子水溶性多糖可能通过调控PI3K/Akt和TLR4/NF-κB信号通路对MNU诱导的大鼠RP起到治疗和保护作用,为决明子水溶性多糖成为治疗RP的一种潜在的新药提供理论依据。方法:1.选取Sprague-Dawley(SD)大鼠,腹腔注射MNU诱导构建大鼠视网膜色素变性模型。诱导后的大鼠RP模型灌胃给予50mg/kg、100mg/kg、200 mg/kg决明子水溶性多糖,注射MNU后24h及5d对其进行检测,包括视网膜厚度、视网膜感光细胞凋亡,视网膜电图(ERG)等,验证决明子水溶性多糖的药效及其抗凋亡活性。应用Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达水平,ELISA试剂盒检测Caspase-3蛋白表达水平。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导Müller细胞作为体外模型细胞,给予50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg决明子水溶性多糖72小时后,用流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达水平,ELISA试剂盒检测Caspase-3蛋白表达水平。2.MNU诱导后的大鼠RP模型给于50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg决明子水溶性多糖,ELISA试剂盒检测肿瘤坏死因子α(TNF-α),白介素1β(IL-1β),白介素6(IL-6)和白介素18(IL-18)表达水平。LPS诱导视网膜小胶质细胞作为体外模型细胞,并给予50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg决明子水溶性多糖2小时和4小时后,用ELISA试剂盒检测TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-18表达水平。3.运用基因芯片筛选相关凋亡和炎症基因,再结合生物信息学方法预测得出可能的相关信号通路。通过聚类分析,功能分析和动态网络分析等生物信息学方法,全面挖掘在决明子水溶性多糖调控MNU诱导的大鼠视网膜色素变性起关键作用的基因及其信号通路,并就筛选得到的关键基因的蛋白表达行进一步分析。然后,Western blot检测相关蛋白的表达量,明确决明子水溶性多糖调控MNU诱导的大鼠视网膜色素变性的分子机制。结果:1.决明子水溶性多糖(50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg)能不同程度的抑制MNU注射后24h及5d所致的视网膜病理组织结构损伤,并且这种保护作用表现为剂量依赖性。决明子水溶性多糖(100mg/kg和200mg/kg)可以明显增加视网膜厚度。2.决明子水溶性多糖(100mg/kg和200mg/kg)可显著抑制注射MNU后24h及5d所致的感光细胞凋亡,并呈现剂量依赖性。3.MNU诱导的大鼠RP模型,ERG检测发现a波和b波振幅降低,决明子水溶性多糖(50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg)能不同程度的提高MNU注射后24h及5d的ERG的a波和b波振幅。4.造模24小时和5天,决明子水溶性多糖通过调控Bax,Bcl-2,Caspase3,casepase9凋亡蛋白(Bax,Casepase-3表达减少,Bcl-2表达增加),参与减少视网膜感光细胞的凋亡。在体外研究中,决明子水溶性多糖同样通过调控Bax,Bcl-2,Caspase3凋亡蛋白,降低细胞凋亡率和细胞毒性(细胞外乳酸脱氢酶LDH的水平)。5.造模24小时和5天,决明子水溶性多糖减少视网膜组织炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-18水平,并呈现剂量依赖性;同时,在体外模型给予决明子水溶性多糖2h和4 h后,视网膜细胞中TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-18水平降低,并也呈现剂量依赖性。6.运用基因芯片筛选相关凋亡和炎症基因,再结合生物信息学方法预测筛选得出可能的相关信号通路,PI3K/Akt和TLR4/NF-κB。在大鼠模型中,决明子水溶性多糖增加PI3K和p-Akt蛋白的表达,同时抑制TLR4和NF-κB蛋白表达,均呈现剂量依赖性;在细胞水平上,决明子水溶性多糖同样增加PI3K和p-Akt蛋白的表达和抑制TLR4/NF-κB蛋白表达,同样也呈现剂量依赖性。结论:1.决明子水溶性多糖对MNU诱导的RP具有明显的保护作用。2.决明子水溶性多糖可能通过激活PI3K/Akt通路,从而影响相关凋亡蛋白的表达,进而发挥抗凋亡作用,阻止大鼠RP的发生,并起到治疗作用。3.决明子水溶性多糖可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路,从而降低TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-18表达水平,减少视网膜组织和细胞炎症,进而发挥抗炎作用。4.本课题的研究结果有助于进一步理解RP的发病机制,为临床应用决明子水溶性多糖预防和治疗RP提供了实验依据,使决明子水溶性多糖有望成为治疗RP的一种潜在的新药。