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慢性粒细胞白血病（Chronic Myelogenous Leukemia，CML，简称慢粒）是一种起源于多能干细胞异常克隆的恶性增殖性疾病。绝大多数慢粒患者白血病细胞中具有Ph染色体，是由9号染色体长臂3区4带和22号染色体长臂1区1带相互易位形成，即t（9；22）(q34：q11)，使位于9q34的c-abl原癌基因在第二外显子的5′端断裂并易位到22q11的M-bcr基因第2或第3外显子的3′端，形成异常的bcr-abl嵌合基因，该基因转导出异常的mRNA，编码并翻译出P210蛋白，该蛋白具有很强的酪氨酸激酶活性，使粒细胞发生恶性增殖。K562细胞属于慢粒急变、红白血病细胞株，具有Ph染色体。 由于P210蛋白的酪氨酸激酶活性是促使慢粒细胞恶性增殖的重要原因，特异性抑制bcr-abl表达蛋白的酪氨酸激酶活性的药物是近来慢粒治疗研究的热点，最近出现的靶向治疗药物STI571就是目前最特异的酪氨酸激酶抑制剂，在慢粒治疗上具有革命性的开拓意义。其治疗慢粒的作用表现在：特异性抑制cv-abl酪氨酸激酶活性，选择性抑制bcr-abl阳性克隆生长，诱导bcr-abl阳性细胞凋亡和分化，改变bcr-abl下游基因的表达，影响肿瘤细胞的粘附功能及调节细胞周期蛋白的表达。尽管其具有明显的抗白血病作用，但随着其应用的推广，逐渐发现其仍存在着耐药、停药后复发以及对CML急变期疗效差等诸多问题，因而探讨治疗CML的新途径和新策略是当今研究的一个发展方向。第四军医大学博士学位论文 近来发现，细胞周期调控失调与肿瘤的发生、发展有密切联系。细胞周期受细胞周期素（Cyclin）和周期素依赖激酶（CDK）、周期素依赖激酶抑制剂（CKIs）的网络状调控。Cyclin及CDK对细胞周期起正相调控作用，CKIS对细胞周期起负相调控作用。CKIS包括两类，一类为Ink4（inhibitor of CDK4）家族，包括P16、pls、P一8、P19等，特异性抑制eyelino一eoK4/6复合物的磷酸化激酶活性;另一类为Kip（kinase inhibition protein）家族，包括PZI、P27、P57等，主要抑制eyClinE/eyClinA一CDKZ的功能。这些蛋白中以P16、P15、PZI、P27的功能最重要，它们都具有抑癌基因样的作用，其缺失、突变对于诱发多种肿瘤细胞的恶变方面具有重要的作用，是目前研究的热点和重点。在K562细胞中，已发现有P16基因纯合缺失，P21蛋白功能表达的缺如，因而，进一步研究这四种蛋白功能的失调在慢粒发病中的作用，具有重要的意义。通过构建这四种基因的真核表达载体，转染入K562细胞，并且将基因克隆治疗与ST工571联合应用，了解其对于K562细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响，对于慢粒的研究是一个创新性的尝试，对于指导慢粒的临床治疗具有深远的意义。 本实验通过RT-PCR方法从外周血单个核细胞中扩增出P21、P27、P16、P15基因，胶纯化回收后连接到T载体测序，序列正确后分别构建p21一peDNA3.l、p27一peDNA3.l、p16一peDNA3.1、p15一peDNA3.l真核表达载体，将四种重组构建的载体分别以脂质体转染入慢粒急变、红白血病一K562细胞株，经G418筛选得到稳定转染了四种重组载体的K562细胞株，分别命名为pZI一peDNA3.l一K562、p27一peDNA3.l一K562、P16一peDNA3.l一K562及pls一peDNA3.l一K562细胞株。Westem blot证实转染后分别有PZI、P27、P16、P15蛋白的表达，证明转染成功。用MTT法检测细胞存活率，了解转染后对k562细胞的增殖抑制作用;用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。同时，结合对STI571、HMBA的研究，了解STI571与PZI、P27、P16、P15基因克隆联合作用后对于K562细胞增殖、细胞周期及凋亡等的影响。为指导慢粒的治疗提供了新的方法和途径。 本实验结果和结论如下:1.STI571能明显抑制k562细胞增殖，细胞阻滞于GO/GI期，且具有明显的诱第四军医大学博士学位论文导凋亡作用。 通过MTT检测STI571作用下K562细胞存活率，免疫酶联检测显示，随时间延长或STI571浓度增加，K562细胞的细胞存活率逐渐下降。其规律与光吸收OD值相同。提示STI571能明显抑制K562细胞的增殖，且呈时间和剂量依赖性。流式细胞仪检测显示，较对照K562细胞相比，STI571作用后K562细胞中Gl期细胞明显增加，S期细胞明显减少。表明STI571主要有G1期阻滞作用，通过Gl期阻滞使进入S期DNA合成和复制的细胞明显减少，从而发挥抑制细胞增殖的作用。流式细胞图中的二倍体峰前可见一明显亚二倍体峰一凋亡峰（apoptosis peak），提示STI571能明显诱导K562细胞凋亡。 电镜下发现，STI571作用于K562细胞12一24小时后，细胞形态发生变化，出现早期的凋亡细胞，其形态特点为:染色质边聚，略呈块状，胞浆浓缩，电子密度增高，表面微绒毛减少，细胞突起减少。作用36h后，出现典型的凋亡细胞，其形态特点为:染色质聚集成团块状，靠近核膜边缘，核膜完整清晰，内质网、线粒体扩张，部分有空泡变形，细胞膜完整。作用48h后出现晚期的凋亡细胞，其形态特点为:细胞器轻度变形，内质网扩张，胞膜完整，染色体分裂成块状（似核碎裂），部分区域可见核膜结构。脱出的部分细胞核被完整的胞膜包绕，有较少的细胞器，细胞体积小，胞浆突起，形成凋亡小体。RT一PCR检?