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目的:涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)是最常见的涎腺恶性肿瘤之一,约占涎腺恶性肿瘤的22%。此肿瘤无包膜,侵袭性很强,易于早期侵犯神经,引起感觉异常、麻木和疼痛。发生在腮腺者可以引起面神经麻痹或瘫痪,给患者带来极大的痛苦,也给临床治疗带来很大困难。SACC主要由肿瘤性肌上皮细胞(neoplastic myoepithelial cells,NMCs)和腺上皮细胞构成。NMCs双向分化,它不同于正常肌上皮细胞之处,就是具有分泌蛋白多糖(proteoglycans, PGs)的功能。NMCs分泌的PGs,形成了SACC的筛孔状结构,使SACC出现特有的形态学特征。在每个肿瘤细胞团片中,形成富含PGs的大小不等的囊腔,呈筛孔状分布于肿瘤实质区,PGs为肿瘤的生长提供必要的营养来源。PGs是由一种核心蛋白连接氨基葡聚糖(glycosaminoglycans, GAGs)构成的大分子糖蛋白,广泛存在于哺乳动物细胞以及机体的每种组织中。构成细胞外间质的主要成份,在细胞外基质的合成与沉积、细胞膜信号传导、保持组织水分及与组织间物质交换等生理过程有重要的作用。研究发现,在肿瘤的基质中PGs和GAGs的含量往往高于其相应正常组织及其周围组织,并在肿瘤细胞的生长、粘附和迁移、细胞分化、形态发生以及病毒感染等过程中起关键作用。对于PGs在肿瘤发生发展中作用的研究,已成为越来越多的学者关注的热点。PGs合成是在木糖转移酶(xylosyltransferase)的催化下起始,将一分子木糖基连接到核心蛋白多肽链的丝氨酸残基上,形成O-糖苷键(O-glycosidic bond),并以此开始GAGs侧链的形成,进一步修饰合成PGs。目前已知的木糖基转移酶有两种:木糖基转移酶-I(xylosyltransferase, XT-I)和木糖基转移酶-II(xylosyltransferase, XT-II)。其中XT-I催化的是PGs合成中的效率-限制性阶段(rate-limited step),对PGs的生物合成至关重要。XT-II是XT-I的一个亚型,与XT-I有55%相同的氨基酸序列,并且可以参与PGs的合成。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是将与靶基因的mRNA同源互补的双链RNA(dsRNA)导入细胞,能特异性地降解细胞中mRNA,从而产生相应功能表型缺失,起到转录后水平的基因沉默(post-transcriptional gene silence, PTGS)效果。本实验拟通过RNAi技术,从基因水平上沉默SACC细胞中XT-I基因的表达,从而阻断PGs的生物合成。并通过裸鼠体内试验观察PGs合成分泌抑制前后,SACC细胞嗜神经生长生物学行为的变化,为了解SACC神经侵袭的机制提供新的理论依据,并为SACC的临床治疗提供新思路、开创新途径。方法:1、将shRNA真核表达载体shRNA-WJ4和shRNA-HK(阴性对照)通过脂质体转染SACC-83细胞,沉默SACC-83细胞XT-I基因的表达;2、采用Real-Time PCR技术,从mRNA水平检测RNAi后SACC-83细胞XT-I基因的表达;3、应用Blyscan Assay Kit试剂盒检测基因沉默后SACC-83细胞PGs合成分泌的改变;4、裸鼠移植瘤试验采用18只3周龄雌性BALB/C-nu裸鼠,体重14~15g,随机分为3组。于基因转染SACC-83细胞48h后,收集SACC-83-WJ4(实验组)细胞;SACC-83-HK细胞(阴性对照)和SACC-83细胞(空白对照组),制备细胞悬液,以尾根与右侧膝关节连线的中点作为注射点,进行肌内注射,每只裸鼠注射瘤细胞1×107个/ml×0.2ml。于无特定病原菌(specific pathogen free, SPF)条件下饲养,第15天麻醉处死裸鼠,取右侧后肢标本固定于10%中性甲醛溶液中,10%甲酸脱钙48 h,石蜡包埋,连续切片,切片厚度2.5μm,HE染色,观察瘤细胞侵袭神经的情况。统计学分析:所有实验数据采用SPSS 13.0统计分析软件进行单因素方差分析,P<0.05表示具有统计学意义。结果:1、shRNA-WJ4成功转染SACC-83细胞,转染shRNA-WJ4后细胞稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP),转染效率43.3%。2、基因转染48h后收集细胞,进行Real-Time PCR时实定量,检测shRNA-WJ4细胞XT-I基因mRNA沉默效率为43.0%。3、基因转染48h后收集细胞,应用Blyscan Assay Kit试剂盒检测基因沉默后SACC-83细胞PGs合成分泌降低30.25%。4、裸鼠移植瘤嗜神经侵袭试验显示,SACC-83-WJ4组肿瘤的神经侵袭率为33.3%;明显少于SACC-83-HK组(100%)和SACC-83组(100%),(P<0.05)。抑制PGs的合成分泌后SACC-83细胞嗜神经生长的能力明显降低。结论:靶向沉默SACC细胞XT-I基因,阻抑PGs分泌,可有效抑制肿瘤细胞嗜神经生长的特性。