背景与目的糖尿病是一种慢性代谢性疾病,流行范围广泛,对生命健康影响很大。2型糖尿病是心血管疾病最重要的危险因素之一,糖尿病如果控制不良会导致冠心病、视网膜眼底病变、肾脏血管病、糖尿病足等病症。超过一半的2型糖尿病患者最终因为罹患心肌梗死、中风等心血管并发症而死亡。动脉粥样硬化、血管内皮细胞功能紊乱、细胞凋亡等在糖尿病性心血管并发症的发生发展中具有重要的作用,在血管内膜发生破坏早期便可以检测到内皮细胞凋亡。DPP4(dipeptidyl peptidase-4,二肽基肽酶4)抑制剂是一类口服降糖药物,具有降低血糖效果明显、致低血糖发生率低、不引起体重增加等优点,被用于糖尿病治疗中。近期研究发现,DPP4抑制剂除了降糖作用之外,尚具有心血管保护功能,能够改善内皮细胞功能紊乱、增强内皮eNOS磷酸化水平和减少动脉粥样硬化斑块大小。DPP4抑制剂甚至能够改善心衰的严重程度。但是,目前对DPP4抑制剂在内皮细胞凋亡调控中的作用及其分子学机制尚不可知。AMPK(AMP-activated protein kinase,AMP依赖性的蛋白激酶)是生物体内一种重要的细胞能量和应激的感受分子,是细胞能量代谢调节的重要调节体。既往研究发现,AMPK的激活与心血管代谢性疾病密切相关。在HUVEC细胞中,AMPK的磷酸化激活可以显著的改善氧化应激引起的细胞凋亡,血管AMPK的失调与血管病密切相关,AMPK的调节在心血管代谢性疾病和细胞凋亡中具有重要的作用。在本研究中,我们试图揭示DPP4抑制剂在内皮细胞凋亡调控中的作用,探索AMPK在该调控过程中的角色,并对其可能分子学机制进行研究。方法1.DPP4抑制剂对ROS(relative oxygen species,活性氧)、线粒体膜电位、细胞凋亡的影响将人脐静脉内皮细胞分为三组,分别为空白对照组、高糖刺激组、DPP4抑制剂组。高糖刺激组加入葡萄糖(33 mM),DPP4抑制剂组加入西格列汀(1μM),置于细胞培养箱中培养48h后,利用流式细胞仪检测技术对活内皮细胞的ROS、线粒体膜电位、细胞凋亡情况进行检测。选用h2dcfda荧光探针作为标记物检测内皮细胞内ros,采用jc-1荧光探针对线粒体膜电位水平进行检测,选用annexinv-fitc/pi双标记荧光素探针对活细胞凋亡情况进行检测。2.dpp4抑制剂对ampk活化的影响a:检测西格列汀随时间增加对ampk磷酸化的影响。在内皮细胞中加入西格列汀(1μm),分别培养30min、1h、2h、4h,并且设置ampk激动剂aicar(100μm)培养30min作为阳性对照。采用westernblot技术检测ampk的磷酸化水平程度。b:检测ampk抑制剂compoundc对dpp4介导的ampk磷酸化的作用。分为空白对照组、西格列汀组、ampk抑制剂组、compoundc对照组。西格列汀组加入西格列汀(1μm)、ampk抑制剂组加入西格列汀(1μm)和compoundc(10μm)、compoundc对照组加入compoundc(10μm),培养2h,采用westernblot技术检测ampk的磷酸化水平程度。3.ampk在dpp4抑制剂调节内皮细胞凋亡中的作用将内皮细胞分为空白对照组、高糖刺激组、dpp4抑制剂组、ampk抑制剂组、ampk激动剂组。利用流式细胞仪检测技术,分别检测各处理ros、线粒体膜电位、细胞凋亡情况。结果1.给予内皮细胞高葡萄糖刺激,可以引起细胞ros水平升高,线粒体膜电位破坏、细胞凋亡增强;2.在高糖培养的内皮细胞中加入dpp4抑制剂西格列汀可以降低细胞胞内ros水平,改善线粒体膜电位破坏,有效的降低细胞凋亡比率;3.西格列汀可以增强ampk的磷酸化,从30min开始,持续增强到2h。ampk抑制剂compoundc可以有效的减弱西格列汀介导产生的ampk磷酸化;4.ampk抑制剂compoundc可以逆转高糖培养的内皮细胞中,西格列汀介导的内皮ros水平降低、线粒体膜电位破坏改善和细胞凋亡减轻的益处。ampk激动剂aicar表现出与西格列汀相同的降低ros水平、改善线粒体膜电位破坏和减弱内皮细胞凋亡的作用。结论1.实验结果显示,dpp4抑制剂西格列汀可以有效的减弱高糖刺激引起的ros水平升高、线粒体膜电位破坏和内皮细胞凋亡;2.我们的研究揭示了一种新颖的机制,DPP4抑制剂西格列汀在内皮细胞凋亡调节中的保护作用是通过激活AMPKα活化而发挥作用的,这为西格列汀在糖尿病血管并发症的治疗提供了新的证据。