一、研究背景肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是临床上常见的高致死率恶性肿瘤,5年死亡率超过90%,仅次于肺癌和胃癌。我国是HCC高发地区,每年发病人数占全世界发病率50%。乙肝病毒(HBV)感染是HCC最主要的诱发因素之一,而我国HBV感染率高达58%,全国病毒携带者总数超过1亿。因此,HBV诱发的肝细胞癌已成为我国最重要的公共健康问题之一。手术是治疗HCC的首选方法。但是,由于诊断技术限制,80%的患者确诊时通常已失去手术治疗机会。因此,对于绝大多数HCC患者,安全有效的药物治疗极其重要。细胞色素P450酶(CYPs)和葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)是肝脏最主要的药物代谢酶,广泛参与了各种抗肿瘤药物的代谢,从而影响肿瘤及癌旁正常细胞对药物的敏感性。同时,这些代谢酶还参与了各种(前)致癌物质的活化和灭活,与肿瘤的发生和发展密切相关。多数抗肿瘤药物在对肿瘤产生毒性作用的同时也会对正常组织造成损伤。临床上使用这些药物对HCC患者进行治疗时很难预测药物对肿瘤的杀伤效能及对周围组织的毒副作用。其主要原因是代谢酶的个体差异及其在HCC疾病状态下活性和表达的变化,造成了药物在体内动力学和药效学的改变。因此,系统地阐明HCC状态下CYPs和UGTs酶的表达及活性变化,对抗肿瘤药物的合理使用及对治疗效果的预估意义重大。另外,由于CYPs和UGTs酶的表达存在很大的个体差异,临床上很难对每个患者肝组织中代谢酶的变化做出准确判断。因此,建立灵敏便捷的定量检测方法对个体中CYPs和UGTs酶的代谢能力进行监控,对于HCC个体化治疗具有重要意义。二、研究方法本研究共采集26例中低分化HCC患者肝组织样本,对肿瘤组织和癌旁组织中CYPs和UGTs代谢酶的表达差异进行了系统研究。具体过程如下：采用差速离心法分别提取个体肿瘤组织及癌旁组织微粒体蛋白。建立LC-MS/MS蛋白定量方法,利用非同位素标记探针多肽对各样本中7种CYPs亚型及5种UGTs亚型进行绝对定量,考察HCC肿瘤与癌旁组织中各种代谢酶的蛋白表达差异及其变化规律。建立肝微粒体体外代谢模型,采用探针底物法对HCC肿瘤组织及癌旁组织中7种CYPs酶代谢活性进行评价。同时,测定抗癌药物索拉菲尼及替加氟在肿瘤及癌旁组织样本中的酶代动力学参数,考察HCC肿瘤组织对治疗药物处置能力的变化。提取HCC患者肝组织总RNA,采用Real-Time PCR方法研究肿瘤及癌旁组织中各CYPs亚型mRNA表达差异,阐明HCC肿瘤中CYPs蛋白及活性变化的初步原因,为进一步从转录水平研究其具体分子机制提供参考。三、实验结果1.HCC肿瘤组织中CYPs和UGTs蛋白表达变化研究本研究建立了一种准确、稳定、灵敏的LC-MS/MS方法可同时对人肝微粒体中7个CYPs和5个UGTs亚型进行绝对定量。利用这个方法,我们首次对HCC肿瘤组织及癌旁组织中CYPs和UGTs酶的蛋白绝对含量进行了测定。结果表明,与癌旁组织相比,80%以上患者肿瘤组织中CYPs蛋白表达水平显著降低。其中CYP1A2平均蛋白表达降低了20倍(34.4±14.3 vs 1.8±1.6 pmol/mg microsomal protein),CYP3A4(34.8±16.5 vs 5.5±8.9)、2D6(13.9±9.0 vs 3.8 ±2.6)、2C8(56.0±26.9 vs 6.1±5.1)、2C9(85.0±35.4 vs 8.4±9.0)和2E1(30.0±13.0 vs 7.7±11.8)降低了4-10倍,而CYP2A6仅降低了2倍(12.3±8.5 vs 6.5±17.1)。对UGTs酶蛋白定量结果显示,与癌旁组织相比,肿瘤组织中UGT1A1 (23.1±8.4 vs 9.1±8.4 pmol/mg microsomal protein)、1A4 (56.5±36.0 vs 13.5± 16.2)、1A9 (24.4±19.1 vs 13.3±11.8)、2B7 (37.2±26.4 vs 5.6±8.2)蛋白表达显著降低2-7倍。但是,UGT1A6表达并未下调(14.7±10.2 vs 23.1±21.8,p>0.05),其蛋白表达仅在20%的肿瘤中降低,而在50%患者肿瘤组织中显著升高。提示UGT1A6可能与HCC肿瘤细胞耐药机制有关。另外,UGT1A6还可能作为HCC治疗的新靶点,为代谢酶相关治疗药物开发提供新思路。在正常人肝微粒体中(rHLMs-pooled), CYP2E1蛋白表达水平最高(30%),其次为CYP2C9 (21%)和CYP2C8 (14%)。 CYP3A4和CYP2D6是CYPs家族中最重要的两个亚型,参与了市场上50%药物代谢。但是,其蛋白表达比例仅为14%和5%。正常人肝微粒体中UGTs家族各亚型蛋白表达量差异较小。其中CYP1A4表达最高(占29%)。而主要参与药物等外源性物质代谢的亚型UGT1A1和UGT1A9也占了36%。HCC患者癌旁肝组织微粒体(nHLMs-pooled)中CYPs和UGTs各亚型的比例与正常人没有显著的差异。但是,HCC肿瘤组织中代谢酶的蛋白表达比例出现了较大变化。UGT1A6在癌旁组织或正常肝组织中只占9～13%,而在肿瘤组织中,UGT1A6蛋白表达比例升高到38%。相反,肿瘤中UGT2B7表达比例从原来的22%降到了8%,同时UGT1A4也明显降低(由38%降到22%)。CYP2A6蛋白表达比例在HCC肿瘤组织中明显增高,而CYP3A4和CYP1A2明显降低,其他亚型比例与正常组织相当。本研纳入的25例肝组织样本中CYPs和UGTs表达具有很强的个体差异性,这种特征与文献报道一致。癌旁组织中CYP1A2和UGT2B7个体间表达差异高达52和39倍。CYP3A4,2D6,2C9和UGT1A1、1A9等与药物代谢密切相关的亚型在个体间表达差异为4-17倍。本研究定量结果还发现,HCC肿瘤中各种CYPs和UGTs亚型的蛋白表达也表现出了很强的个体差异性。而且由于肿瘤细胞对代谢酶调节机制存在个体差异,很多亚型在个体肿瘤组织间的表达差异性远大于癌旁组织。CYPs和UGTs代谢酶对于各种外源性物质包括抗癌药物的活化或灭活具有重要作用。而这些代谢酶表现出的个体化差异会使得药物在个体代谢出现很大差异,从而使给予不同个体相同剂量药物时,产生截然不同的治疗作用或毒性作用。这种因人而异的治疗差异会严重影响临床疾病如肝癌的药物治疗。因此,针对CYPs和UGTs表达差异的个体化治疗方案对于肝癌的治疗将会有重要意义。2.HCC肿瘤组织中CYPs酶代谢活性及其对抗肿瘤药物处置能力变化研究本研究系统的阐明了HCC肿瘤组织及其癌旁组织中7种CYPs亚型对探针底物代谢能力的变化特征。酶代动力学研究结果表明,与癌旁组织相比,HCC肿瘤组织中各种CYPs亚型对探针底物的清除速率均显著降低。其中,CYP3A4和CYP1A2降低了20倍以上,CYP2D6、2C8、2C9和2E1降低了8倍,而CYP2A6仅降低了2倍。个体研究结果也显示CYPs酶的代谢活性在80%以上患者肿瘤组织中降低了3倍以上。但也有部分肿瘤中CYPs活性未发生显著变化,甚至出现增高,提示HCC肿瘤对CYPs活性的调控机制具有个体化差异。这些结果与HCC肿瘤组织中CYPs蛋白表达变化趋势高度一致。说明肿瘤组织中CYP酶代谢速率的改变可能是由于蛋白含量变化所引起。另外,引起代谢速率改变的另一个原因是代谢酶蛋白分子本身催化能力的改变。本实验通过计算CYPs酶对探针底物的转化速率(TON)评价各CYPs亚型的催化能力。结果显示,肿瘤组织中,除了CYP2C9和CYP2D6催化能力轻微变化(小于2倍),其他CYPs亚型催化能力均与癌旁组织和正常组织无显著性差异。酶动学研究也表明肿瘤组织、癌旁组织和正常人肝组织中各种探针底物代谢的Km值都没有明显差异,并且表现相同的动力学特征。这些结果提示HCC肿瘤组织中CYPs酶蛋白分子基本特征并没有显著改变,CYPs酶代谢速率的改变并不是由于催化能力降低引起。HCC肿瘤组织中CYPs代谢酶活性的降低会直接导致组织对药物及内源性物质处置能力改变。本研究对临床治疗HCC常用药物索拉菲尼和替加氟在肿瘤组织中的代谢速率进行了研究。结果显示,索拉菲尼在肿瘤组织中的灭活速率大幅度降低。这将会导致索拉菲尼更容易在肿瘤细胞内产生蓄积,增加了药物对肿瘤的杀伤作用,而在癌旁组织中药物则可以被正常的代谢。这可能是索拉菲尼治疗HCC时较少出现肝毒性的一个原因。另外,研究结果还显示,替加氟在肿瘤组织中活化为5-氟尿嘧啶的速率也显著降低。提示替加氟在正常组织中的活化速率会显著高于肿瘤组织,从而对正常肝组织产生更大的毒副作用。但是,在某些HCC患者肿瘤组织中(5号和20号)5-氟尿嘧啶的生成速率远远大于癌旁组织。临床上对这类患者使用替加氟治疗时,可能会显著提高药物杀伤肿瘤的作用,同时也会降低对周围肝组织的毒副作用。3.HCC肿瘤组织中CYPs酶mRNA表达变化研究本研究采用Real-Time PCR对HCC患者肿瘤组织及对应癌旁组织中7种CYPs酶亚型mRNA表达水平进行了定量研究。结果显示各种CYPs亚型在肝肿瘤组织及癌旁组织中均有表达。通过对比发现,大多数肿瘤组织中CYPs各亚型mRNA表达水平较癌旁组织均出现显著降低。与癌旁组织相比,肿瘤组织中CYP3A4 mRNA平均表达水平降低了23倍。CYP2C8、2C9和2E1也降低了6-7倍。但是,肿瘤组织中CYP2D6平均表达量只降低了2.5倍。该结果与HCC肿瘤组织中CYPs各亚型蛋白表达降低趋势一致。说明HCC肿瘤细胞可能在转录水平对CYPs酶的表达进行了调控,降低了mRNA表达水平,从而使CYPs蛋白表达下调。但是,部分个体肿瘤组织mRNA和蛋白表达水平变化不一致。这可能是肿瘤细胞通过转录后调控机制改变了mRNA稳定性,或通过翻译后修饰改变了CYPs蛋白的稳定性,从而使肿瘤细胞蛋白及mRNA降解速率出现差异。相关性分析发现,癌旁组织中7种CYPs亚型mRNA表达水平之间具有广泛的相关性。其中,CYP2C8、2C9和2A6 mRNA表达具有强相关性(r2≥0.8),提示这三种亚型转录过程可能具有相同的调控通路。除了CYP2E1外,CYP3A4与其他亚型mRNA表达也具有中等强度的相关性,提示这些亚型转录过程可能具有共同的调控因素,同时也会受到特殊调控因子的影响。但是,在HCC肿瘤组织中,CYPs酶mRNA表达水平之间的相关性减弱甚至消失,这可能是由于肿瘤细胞中各种核受体表达水平改变,从而造成CYPs调节紊乱所致。4. CYPs酶蛋白的变化与代谢活性及其对药物处置能力的相关性研究分别采用LC-MS/MS蛋白定量方法及探针底物法测定HCC患者肝组织微粒体中7种CYPs酶蛋白表达及其代谢活性,并进行相关性分析。结果显示,HCC肿瘤组织及癌旁组织中CYPs酶代谢活性与其蛋白表达水平具有高度相关性。其中CYP2A6和CYP2D6的活性和蛋白表达相关性最强,相关系数大于0.9。此结果进一步说明了HCC患者肝组织中CYPs酶代谢活性的改变主要是由蛋白表达变化造成。另外,HCC肿瘤组织和癌旁组织中CYPs活性与其蛋白表达水平线性回归斜率相似,说明两种组织中CYPs酶蛋白分子催化活力相当。以上结果提示,测定HCC患者肝组织中CYPs代谢酶的蛋白含量可有效地对其活性变化进行评价,从而预测药物在HCC患者肝组织中的代谢速率。CYPs和UGTs酶广泛参与了抗肿瘤药物的代谢。相关性分析结果显示,HCC患者肝组织中,替加氟和索拉菲尼代谢速率速率分别于与CYP2A6和CYP3A4的活性及蛋白表达水平显著相关。提示代谢酶活性可直接影响肿瘤药物的活化或灭活速率。那么,对代谢酶的活性变化进行准确评价可有效地对药物治疗效果及毒性进行预测。四、结论综上所述,HCC肿瘤中CYPs酶代谢活性显著降低,其主要原因为CYPs酶蛋白及mRNA表达水平下调所致,而酶蛋白分子催化能力并未显著改变。HCC肿瘤组织中CYPs表达的变化可显著改变索拉菲尼和替加氟等抗癌药物的代谢速率,推测可能会对药物疗效和毒性产生重要影响。本研究建立了一种快捷稳定的LC-MS/MS方法可同时测定HCC肿瘤和癌旁组织中各种CYPs和UGTs蛋白绝对含量。利用此方法可准确的对患者肝组织各种代谢酶活性进行评价,从而对肿瘤组织和癌旁组织中药物活化或灭活速率进行预测。我们期望本研究可为HCC患者合理用药,提高药物治疗作用而降低毒副作用提供新的方法和思路。