足细胞(podocyte)是一种高度分化的终末期细胞,位于肾小球毛细血管膜外,呈星形多突状,是肾小球滤过屏障的重要组成部分。足细胞损伤是肾小球硬化的关键因素,越来越多的证据表明,在多种肾小球疾病中,如膜性肾病(membranous nephropathy,MN)、微小病变性肾病(minimal change disease, MCD)、局灶节段肾小球硬化(focal segmental glomerulonephritis,FSGS)及糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)等,足细胞损伤引起蛋白尿,加速肾小球疾病进展为肾小球硬化,最终成为慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD),不可避免的走向肾脏替代治疗的道路。因此,充分了解足细胞损伤发生的机制,找到控制足细胞损伤的方法,是阻断CKD发生发展的关键。炎症小体(inflammasome)由Tschopp于2002年首先提出,是指含有NOD样受体(NOD-like receptor,NLR)家族成员蛋白形成的复合体,包括NLRP1、 AIM2、NLRP3、NLRC4等炎症小体。在这些炎症小体中,对NLRP3(NOD-like receptor family,pyrin domain containing 3)炎症小体研究最多,其基本结构单位是由NLRP3、接头蛋白ASC(apoptosis speck protein with CARD)和胱天蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific protease,caspase-)-1组成。在静息状态下无活性,当细胞受到特定刺激后,NLRP3与ASC结合,招募pro-caspase-1形成复合体,使其成为有生物活性的caspase-1,即白细胞介素(interleukin,IL) -1β转化酶,后者作用于炎症因子前体如pro-IL-18等,产生具有致炎活性的IL-18,参与机体天然免疫应答及细胞损伤。有报道表明,NLRP3炎症小体与多种肾脏疾病,如肾脏纤维化等相关。但其在足细胞损伤中的作用尚有待进一步阐明。线粒体自噬(mitophagy)在肾损伤中的作用也引起大家的关注。线粒体是能量代谢的重要场所,参与多种细胞生命活动,决定着细胞的生死。其易受到外界因素的损伤,即发生线粒体功能障碍。不需要的或受损的线粒体须被有效清除,以保证细胞进行正常的生命活动。选择性清除不需要的或者受损线粒体的过程称为线粒体自噬。自噬的异常与神经退行性疾病、糖尿病和肿瘤的发生有密切关系。有文献报道,在巨噬细胞中线粒体自噬可以抑制NLRP3炎症小体的产生,但在肾脏中尚未见报道。沉默信息调节因子2(silent information regulator 2, Sir2)一相关酶类(Sir2-related enzymes, sirtuins)是近年来发现的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)依赖的第1II类组蛋白去乙酰化酶类,其中SIRT1研究最为深入。在哺乳动物中,SIRT1主要定位在细胞核,通过乙酰化活性发挥作用。在肾脏中,已有的文献报道SIRT1具有保护作用,如调节血糖和血脂代谢、保护肾小球滤过屏障、调节线粒体功能及能量代谢以及抗纤维化等。同时,SIRT1可以通过对叉头状转录因子O (forkhead box-containing protein O subfamily, FOXO)的去乙酰化调节作用,从而调控自噬的发生,在多种疾病,如糖尿病、肿瘤、肥胖、心血管等疾病中发挥重要作用。我们前期研究也发现SIRT1/PGC-la通过保护线粒体功能抑制醛固酮(Aldosterone,Aldo)诱导的足细胞损伤。综上,本研究推测,SIRT1可以通过促进线粒体自噬,阻断Aldo诱导的线粒体功能障碍,进而抑制JLRP3炎症小体,减轻足细胞损伤,发挥保护作用。为探讨其中的机制,我们进行了如下研究,实验分为三部分。第一部分NLRP3炎症小体在醛固酮诱导的足细胞损伤中的作用目的：探讨NLRP3炎症小体活化在Aldo诱导的足细胞损伤中的作用。方法：免疫组织化学染色检测慢性肾脏病(MCD、FSGS)患儿肾组织中NLRP3的表达。体外培养小鼠足细胞系MPC5,应用不同浓度的Aldo (25、50、100、 200 nM)刺激不同的时间(2、4、8、12、24、48 h)。体外应用NLRP3 siRNA转染足细胞24h,加Aldo刺激,分为四组：阴性对照组(negative control,NC)、 NC+Aldo组、NLRP3 siRNA组、NLRP3 siRNA+Aldo组。体外应用MnTBAP、CsA预处理足细胞30min,再加用Aldo刺激,分组如下：对照组、CsA组、Aldo组、CsA+Aldo组、MnTBAP组、MnTBAP+Aldo组。应用real-time PCR、western blot及ELISA检测足细胞NLRP3炎症小体活化后相关指标(NLRP3、IL-18及caspase-1)的表达。应用caspase-3、-8、9试剂盒检测三者的活性。体内研究中,通过腹腔埋置渗透性微泵构建Aldo肾损伤模型,分别于第1、3、5、7、14天处死小鼠；对NLRP3基因敲除(NLRP3-/-)小鼠亦通过腹腔埋置Aldo渗透性微泵模型,分为四组：野生型对照组、野生型加Aldo组、NLRP3-/-对照组、NLRP3-/-加Aldo组,于第14天处死小鼠,检测尿蛋白、肌酐、PAS染色后光镜下肾组织病理学改变、电镜下足细胞结构改变,免疫荧光检测肾组织中NLRP3的表达,应用real-time PCR及western blot检测足细胞损伤指标nephrin和podocin。结果：(1)免疫组化结果及NLRP3表达量的积分光密度统计值(IOD)显示MCD和FSGS患者肾组织中NLRP3的表达明显增高。原发性肾病综合征患者尿液中IL-18表达较正常对照组明显升高。(2)Real-time PCR、western blot及ELISA结果显示Aldo呈剂量依赖性地诱导足细胞NLRP3和IL-18的表达及分泌,Aldo 50nM刺激24h时NLRP3和IL-18表达开始增加,200nM时达到高峰；Aldo亦呈时间依赖性地诱导NLRP3和IL-18的生成,Aldo 100nM时刺激4h时IL-18的分泌即增加,且一直持续至24h。(3)Aldo灌注小鼠肾损伤模型结果显示,Aldo灌注后第3天NLRP3表达开始增加(主要表达在肾小球足细胞),第5天进一步升高并持续到14天,caspase-1在第7天时上升且14天时最为明显,IL-18于第5天表达增加且持续到14天。Aldo灌注第5天nephrin表达开始下降(降低37%)且持续到第14天。(4)NLRP3 siRNA阻断足细胞NLRP3炎症小体的活化,并抑制Aldo诱导的caspase-1及IL-18表达,以及足细胞凋亡和nephrin表达下降；此外,NLRP3 siRNA亦阻断了Aldo诱导的caspase-3、-8、-9活化。(5) NLRP3基因敲除可显著抑制Aldo诱导的小鼠肾组织NLRP3炎症小体活化,抑制肾小球体积增大和系膜增生,并降低蛋白尿。电镜下Aldo灌注的野生型小鼠出现广泛的足突融合,而NLRP3基因敲除小鼠几乎保持着正常的足细胞形态。NLRP3基因敲除阻断了Aldo对nephrin和podocin表达的抑制作用。(6)CsA可通过阻断mPTP孔的开放,进而减轻Aldo引起的线粒体功能障碍,恢复线粒体膜电位及mtDNA拷贝数。CsA同时抑制NLRP3炎症小体的活化,降低NLRP3表达及炎症因子IL-18释放减少。与CsA作用相似,MnTBAP亦阻断了NLRP3炎症小体的活化。结论：Aldo通过诱导线粒体功能障碍,进而活化NLRP3炎症小体诱导足细胞损伤。第二部分SIRT1对NLRP3炎症小体活化和炎症因子表达的影响目的：探讨SIRT1对NLRP3炎症小体活化和炎症因子表达的影响。方法：应用免疫组化检测慢性肾脏病(MN、MCD、FSGS)患儿肾组织中SIRT1方法：应用免疫组化检测慢性肾脏病(MN、MCD、FSGS)患儿肾组织中SIRT1的表达。体外培养小鼠足细胞系MPC5,应用SIRT1 siRNA转染足细胞。分为三组：空白对照组(control,con)、空载对照组(vehicle,vehi)、SIRT1 siRNA组。应用SIRT1质粒转染足细胞24h,加用Aldo刺激,分为四组：Vehi组、SIRT1过表达组、Vehi+Aldo组、SIRT1过表达+Aldo组。采用荧光探针2,7—二氯二氢荧光素乙酰乙酸(2,7-dichlorofluorescein diacetate, DCHFDA)染料检测细胞内ROS水平；JC-1染色结合流式细胞术检测线粒体膜电位；real-time PCR检测mtDNA拷贝数；AnnexinV-PI双染及流式细胞仪检测足细胞凋亡情况；western blot检测足细胞nephrin、NLRP3的表达；应用caspase-3、-8、-9试剂盒分别检测三者的活性。应用ELISA检测炎症因子IL-18的表达。体内研究中,应用NPHS2-Cre转基因小鼠与SIRT1flox/flox转基因小鼠交配,制备足细胞条件性SIRT1基因敲除小鼠,即SIRT1flox/flox NPHS2cre(+),对照组小鼠为SIRT1flox/flox NPHS2cre(+)对SIRT1flox/flox NPHS2cre(+)小鼠腹腔埋置Aldo渗透性微泵,分为四组：SIRT1flox/flox NPHS2cre(-)对照组、SIRT1flox/flox NPHS2cre(-)+Aldo组、SIRT1flox/flox PPHS2cre(+)对照组、SIRT1flox/flox NPHS2cre(+)+Aldo组。于第14天处死小鼠,检测尿蛋白、肌酐、PAS染色观察肾组织病理学改变、电镜足细胞超微结构改变,免疫荧光检测肾组织中NLRP3及WT1的表达,real-time PCR和western blot检测足细胞标志nephrin和podocin以及NLRP3活化指标NLRP3、caspase-1及IL-18的表达。结果：(1)免疫组化结果显示SIRT1在正常肾组织中高表达,在MN、MCD患儿肾组织中明显降低,而在FSGS患者中几乎不表达。(2)应用siRNA敲低SIRT1后,足细胞出现明显的线粒体功能障碍,ROS产生增加,线粒体膜电位以及mtDNA拷贝数显著下降。同时,足细胞凋亡明显增多,caspase-3、caspase-9活性增加以及nephrin表达降低。敲低SIRT1亦显著促进NLRP3表达及IL-18的分泌。(3)对制备出的SIRT1flox/flox NPHS2cre(+)小鼠进行鉴定,免疫荧光结果显示,足细胞条件性SIRT1基因敲除小鼠(SIRT1flox/flox NPHS2cre(+))肾小球足细胞中SIRT1的表达显著下降。原代分离、培养肾小球足细胞,经免疫荧光WT1染色鉴定纯度>95%后,应用western blot及real-time PCR检测SIRT1表达,结果显示SIRT1flox/flox NPHS2ce(+)、鼠足细胞几乎不表达SIRT1,表明足细胞条件性SERT1基因敲除小鼠制备成功。SIRT1flox/flox NPHS2cr(*+)小鼠在生理状态下与野生型小鼠(SIRT1flox/flox NPHS2cre(-))小鼠无明显差别：两者均无蛋白尿；光镜下肾小球形态正常；足细胞特异性标志物WT1免疫荧光在两组间无明显差别。(4)构建Aldo灌注小鼠模型：野生型小鼠在Aldo灌注后尿蛋白排泄增加近5倍,而足细胞条件性SIRT1基因敲除小鼠尿蛋白排泄增加较野生型小鼠更为显著(近8倍)。光镜下足细胞条件性SIRT1基因敲除小鼠加重Aldo灌注导致的肾小球体积增大和系膜细胞增生；nephrin和podocin的降低更显著；电镜下出现更加广泛的足突融合。野生型小鼠在Aldo灌注后NLRP3、caspase-1及IL-18表达增加,而足细胞条件性SIRT1基因敲除小鼠较野生型小鼠NLRP3炎症小体的活化更为显著。(5)SIRT1过表达显著抑制Aldo诱导的NLRP3和caspase-1 mRNA及蛋白表达,降低IL-18的分泌。同时,SIRT1过表达能够阻断Aldo诱导的膜电位、mtDNA拷贝数以及nephrin和podocin表达的下降。结论：SIRT1可以阻断Aldo诱导的线粒体功能障碍,抑制NLRP3炎症小体活化,减轻足细胞损伤。第三部分BNIP3介导的线粒体自噬在SIRT1阻断NLRP3炎症小体活化中的作用目的：探讨BNIP3介导的线粒体自噬在SIRT1阻断NLRP3炎症小体活化中的作用。方法：应用上述制备的足细胞条件性SIRT1基因敲除小鼠制备Aldo灌注模型,real-time PCR及western blot检测线粒体自噬相关基因(BNIP3、Beclin-1、Atg5及LC3)的表达。体外培养的足细胞转染BNIP3质粒24h后应用Aldo刺激,实验分为四组：Vehi组BNIP3过表达组、Vehi+Aldo组、BNIP3过表达+Aldo组。采用TUNEL检测足细胞凋亡,real-time PCR及western blot检钡nephrin、podocin及NLRP3的表达,荧光探针MitoSOX检测线粒体内ROS水平,real-time PCR检测mtDNA拷贝数,JC-1染色结合流式细胞术检测线粒体膜电位。结果：(1)野生型小鼠Aldo灌注后BNIP3、Beclin-1和Atg5表达增加,而足细胞条件性SIRT1基因敲除小鼠抑制了BNIP3. Beclin-1和Atg5的表达,提示足细胞条件性敲除SIRT1基因抑制线粒体自噬。(2)BNIP3过表达后可阻断Aldo诱导的足细胞凋亡,抑制nephrin、podocin表达下降。另外,BNIP3过表达可显著抑制Aldo诱导的NLRP3炎症小体活化,并阻断Aldo诱导的线粒体功能障碍,恢复线粒体膜电位及mtDNA拷贝数,抑制线粒体内ROS的产生。结论：BNIP3介导的线粒体自噬参与了SIRT1对线粒体功能及NLRP3炎症小体活化的调控。