背景：　　新生儿脑出血和缺氧缺血性脑病是围产期脑损伤的常见类型，常导致严重的长期神经功能和认知功能损伤，如运动障碍或智力发育迟缓等。导致新生儿脑出血的原因较多，包括出血性疾病、低Apgar评分、动脉导管未闭以及阴道分娩和感染等，其中最为常见的是生发基质层出血（Germinal matrix hemorrhage, GMH)。GMH的发生主要是由于新生儿生发基质区域血管的脆性，再加上可能引起脑血流波动因素的影响，导致血液破入脑室，从而引起脑室积水，最终发展为脑瘫和脑萎缩。新生J L缺氧缺血性脑病（Hypoxic-ischemic encepholopathy, H IE)则是由于脑血流的供应不足导致脑组织缺乏氧气以及糖分的供给，产生的一系列生化反应，如细胞内钙离子浓度上升，氧化应激产物增加，炎症因子的聚集以及凋亡事件的发生等，从而导致脑组织的破坏，最终引起运动和记忆功能障碍。鉴于G M H和H IE会影响未成熟脑发育成熟，并可在成熟脑中造成永久性的损伤，因此探讨G M H和H IE病理生理特点对于研究早期药物干预靶点，从而改善新生儿神经功能障碍有着重大的临床意义。　　出血后脑损伤分为原发性和继发性脑损伤。原发性脑损伤通常于出血后几小时开始，主要是由于血肿形成后对邻近组织的机械性压迫所致，而继发性脑损伤，如反应性星形胶质细胞增生，小胶质细胞增生和炎症反应是引起新生儿神经功能障碍的关键步骤，其中以炎症反应最为显著，因此抑制早期炎症反应是减轻GM H所致的脑损伤中最为关键的步骤之一。在脑出血模型中，由于部分小胶质细胞产生大量的炎性损伤因子，因此既往研究的热点在于如何减少小胶质细胞的数量以及在出血部位的聚集。然而近年来有研究发现，在新生儿未成熟脑的特殊发育阶段，使用氯磷酸盐大幅度减少脑组织内小胶质细胞的数量会导致新生儿脑卒中炎症反应的加重。另外在G M H模型中促进M2型小胶质细胞的聚集也有助于抑制炎性因子的释放。　　血液中葡萄糖和氧气是新生儿脑细胞的主要能量来源。由于微血管环境还未发育成熟，新生儿的脑葡萄糖代谢在缺氧缺血时对能量缺乏的抵抗性和敏感性均显著差于成年人，并且更容易出现神经元的凋亡。多项研究表明，依赖于含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)的调亡通路在 HI继发的脑损伤中起着至关重要的作用。除此之外，化学抑制或者基因敲除来降低体内Caspase家族成员的表达水平有助于大鼠神经功能的恢复。因此早期抑制依赖于Caspase通路的神经元凋亡有助于改善缺氧缺血所致的神经功能障碍。　　Chemerin是由体内组织合成的一种含有163个氨基酸的蛋白质，参与多项生理、病理反应，如心血管疾病以及腹部炎症反应等。Chemerin的内源性配体主要有 Chemerin受体23(Chemerin receptor23, ChemR23)，趋化因子 CC基序受体样2(Chemokine CC m otif receptor-like2, CCRL2)以及 G蛋白偶联受体1(G protein-coupled receptor1, GPR1)。大量研究证实，Chemerin激活ChemR23后可有效地抑制腹部炎症模型中炎症因子的产生以及嗜中性粒细胞的迁移，而且还能显著地减少缺血性心肌梗死的梗死面积。然而，Chemerin/ChemR23在新生儿脑卒中的表达情况以及外源性给予Chemerin能否减轻G M H和H IE继发脑损伤及其相关机制仍不清楚。　　结合前期工作基础，本研究采用脑实质内注射细菌性胶原酶(0.3U)诱导P7新生S D大鼠脑出血以及对P10新生S D大鼠进行右侧颈总动脉结扎离断后维持2.5h的低氧暴露，分别模拟新生儿GM H和H IE的病理生理特点，并通过行为学以及细胞生物学表现；针对GM H后小胶质细胞以及H IE后神经元的生物学特点转换，以ChemR23作为干预靶点，探讨 Chemerin/ChemR23调控小胶质细胞表型转换以及减少神经元凋亡的相关机制。1，为新生儿出血性脑卒中继发神经炎症的调控提供新方向；2，为新生儿缺氧缺血性脑卒中神经元凋亡的调控提供新方向；3，为改善新生儿脑卒中短期及长期后遗症的临床救治提供新手段。　　第一部分：Chemerin对新生儿脑室出血继发炎症脑损伤的影响及其相关机制的研究　　目的：　　1.该部分研究探索Chemerin及其内源性配体ChemR23在新生儿G M H模型中的表达情况，提供Chemerin/ChemR23与G M H关联的一些病理生理学证据。　　2.利用重组人 Chemerin(Recombinant human Chemerin, rh-Chemerin)探索外源性激活ChemR23对 G M H继发的神经功能障碍，以及小胶质细胞迁移、增殖和分化的作用。　　3.利用装载有特异性抑制剂的liposome探索Chemerin/ChemR23抗炎机制是否依赖于小胶质细胞中激活钙调素依赖性蛋白激酶激酶2(Calmodulin-dependent protein kinase kinase2, CAMKK2)/腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)/核因子相关因子(Nuclear factor erythroid2-related factor2，Nrf2)这一信号通路实现。　　材料与方法：　　1.采用细菌性胶原酶(0.3U)立体定向微量泵入P7新生S D大鼠的右侧生发基质层构建新生儿GM H模型。通过免疫荧光，蛋白印迹(Western blotting, W B)和逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)技术检测 GMH Oh，3h，6h，12h,24h,72h,5d,7d内源性Chemerin, ChemR23, CCRL2和 GPR1在脑组织中的表达情况。　　2.构建GM H模型后lh通过鼻腔和腹腔注射不同浓度的rh-Chemerin,检测不同浓度以及不同方式的rh-Chemerin治疗方法对于GMH72h神经功能障碍的作用;通过W B分析最佳的给药方式和浓度;使用 Ki67、5-溴脱氧尿啼唆核苷(5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU)、C D llb/c(活化小胶质细胞标志物)以及CD206(M2型小胶质细胞标志物）检测不同干预后72h小胶质细胞迁移、增殖及表型转换情况；通过RT-PCR检测不同干预后72h M2型小胶质细胞的标记物，Arginase-1的m R N A水平变化；通过水迷宫、foot-fault和rotarod分析rh-Chemerin对于GMH4周后认知和运动功能障碍的作用；通过N issl染色检测GMH4周后各组新生大鼠脑皮层厚度及脑室扩张体积；使用外周嗜中性粒细胞标记物（Myeloperoxidase， MPO)和小胶质细胞标记物(Ionized calcium binding adapter molecule1, Ib a l)检测不同干预后3d，14d和28d脑室脉络丛中嗜中性粒细胞和小胶质细胞的数量情况。　　3.将ChemR23小干扰RNA(Small interfering RNA, siRNA)或装载有特异性ChemR23/CAMKK2/A M P K抑制剂的脂质体在构建GMH模型前24h内立体定向微量泵入新生大鼠的右侧脑室内。通过免疫荧光技术检测脂质体进入脑实质的情况；通过W B等检测Chemerin/ChemR23/CAMKK2/AM PK/N rf2以及炎症损伤因子，如白细胞介素-lbeta(Interleukin-lbeta, IL-1 beta),白细胞介素-6(Interleukin-6, IL-6)以及肿瘤坏死因子 alpha(Tumor necrosis factor alpha, TNF alpha)的蛋白含量。　　结果：　　一内源性Chemerin及其相关受体在G M H模型中的表达情况　　1. W B与 RT-PCR的结果显示，内源性Chemerin的表达水平在GM H24h明显上调（p<0.05)，上升趋势一直持续至GMH7d。内源性ChemR23的表达水平在G M H后3 d明显上调（p<0.05)，上升趋势一直持续至GMH7d。Chemerin的另两个配体，CCRL2和GPR1的表达水平差异在GM H后各时间点均没有统计学意义。　　2.免疫突光结果提示内源性Chemerin和ChemR23均与小胶质细胞，星形胶质细胞和神经元有共表达现象，且Vehicle组的Chemerin和ChemR23的荧光强度较Sham组强。　　二 Rh-Chemerin对G M H后神经功能学评分和组织形态学的影响　　1.与Vehicle组比较，三种浓度两种给药方式的rh-Chemerin组在GMH72h的状态明显好转：在righting reflex和negative geotaxis中所花费的时间均显著下降（p<0.05)。W B结果显示鼻腔和腹腔注射rh-Chemerin可在脑组织中检测到，并且鼻腔注射中等浓度(9ng/kg)的rh-Chemerin在 GMH72h脑组织中的含量显著高于腹腔注射同等浓度的rh-Chemerin(p<0.05)。　　2.与Vehicle组相比较，rh-Chemerin能够显著改善GMH28d的神经功能损伤：在water m aze实验中寻找到目标游行距离更短(p<0.05)，花费的时间更少(p<0.05)，在目标区域的时间更长(p<0.05);在 foot fa u lt实验中，左侧肢体错步的次数明显下降(p<0.05)；在rotarod实验中，不论是在5还是lOrpm，在转轮上停留的时间显著增长(p<0.05)。此外，与Vehicle组相比较，rh-Chemerin显著增加GMH14d至28d大鼠的体重(p<0.05)。　　3. N issl染色发现与Vehicle组相比较，rh-Chemerin显著改善GM4周后出现的脑室扩张(p<0.05)，并减轻了脑皮层厚度的缩小和脑白质的萎缩(P＜0.05)。既往研究提示G M H诱导的脑室扩张与脑脊液的产生异常增加密切相关。免疫荧光结果发现与Sham组相比较，Vehicle组脉络丛中MPO+细胞数在GMH3d,14d和28d显著增加(p<0.05)；rh-Chemerin明显减少GMH3d,14d和28d脉络丛中MPO+细胞数(p<0.05)。三组脉络丛中Ibal+细胞数在各时间点无统计学差异。　　三 Rh-Chemerin对炎症因子的释放，以及小胶质细胞迁移、增殖以及表型转换的影响　　1.与Sham组相比较，Vehicle组的脑组织中IL-lbeta，IL-6和TNF alpha的含量在GMH72h时出现显著增加(p<0.05)。与Vehicle组相比较，rh-Chemerin可明显减少上述炎症因子的含量(p<0.05)，而这种抑制作用可被ChemR23 siRNA逆转(p<0.05)。与此同时，经W B验证， ChemR23 siRNA对内源性ChemR23有较好的沉默效果，使蛋白表达量显著减低(p<0.05)。　　2.与 Sham组相比较，Vehicle组的出血侧脑室周围Ibal+和C D llb/c+小胶质细胞数量显著增加(p<0.05)，并且rh-Chemerin组增加得更为明显(p<0.05)。　　3.与 Vehicle组相比较， rh-Chemerin组的出血侧脑室周围Ki67+/Ibal+以及BrdU+/Ibal+小胶质细胞数量显著增加(p<0.05)；但Vehicle组与Sham组之间无统计学差异。　　4.与Vehicle组相比较，rh-Chemerin组的出血侧脑室周围CD206+小胶质细胞数量显著增加(p<0.05)；在 Sham组并未观察到CD206+小胶质细胞。RT-PCR结果显示与Vehicle组相比较，rh-Chemerin可明显增加Arginase1 mRNA水平(p<0.05)。　　四 Rh-Chemerin改善G M H继发炎症脑损伤的机制研究　　1.内源性磷酸化 CAMKK2(Phosphorylated CAMKK2, p-CAMKK2)/CAMKK2，磷酸化 AMPK(Phosphorylated AMPK, p-AMPK)/AMPK以及N r￡2的表达水平在G M H后明显上调(p<0.05)，上升趋势一直持续至G M H第7天。这些上升趋势在rh-Chemerin组更加显著(p<0.05)，并且ChemR23 siRNA可逆转这些上升趋势，提示CAMKK2/AMPK/N rf2可能参与了 Chemerin/ChemR23抗炎反应的过程。　　2.免疫荧光显示装载有特异性抑制剂的liposomes仅被GMH72h后活化的Ibal+小胶质细胞吞噬，同时不影响星形胶质细胞和神经元的功能。Alpha-NETA，STO-609和 Dorsomorphin并不影响 ChemR23的表达量。与 rh-Chemerin组相比较， Alpha-NETA和 S T0609组的P-CAMKK2含量显著下降(p<0.05)，但Dorsomorphin组的p-CAMKK2含量无统计学差异。与rh-Chemerin组相比较，Alpha-NETA, STO-609和 Dorsomorphin组的p-AMPK和 N rf2含量显著下降(p<0.05)。与rh-Chemerin相比较，三组抑制剂均能显著地增加炎性因子，如IL-lbeta、IL-6和TNF alpha的表达量(p<0.05)。　　结论：　　研究发现rh-Chemerin具有减轻G M H继发的神经功能障碍，抑制神经源性炎症等保护效应，而这一保护效应是通过CAMKK2/AMPK/N rf2信号通路实现的，其中聚集在出血侧脑室周围并进行增殖的M2型小胶质细胞可能是这一通路的主要效应细胞。该研究为新生儿GMH继发炎症损伤提供了新靶点，并为新生儿脑出血及其后遗症的临床救治提供了新思路。　　第二部分：Chemerin对新生儿缺血缺氧性脑病神经元凋亡的影响及其相关机制的研究　　目的：　　1.该部分研究探索Chemerin及其内源性配体ChemR23在新生儿H I模型中的表达情况，提供Chemerin/ChemR23与H IE关联的一些病理生理学证据。　　2.利用rh-Chemerin探索外源性激活ChemR23对H I继发短期和长期神经功能障碍，以及神经元凋亡和氧化应激反应的影响。　　3.利用特异性抑制剂探索Chemerin抗调亡效应是否依赖于ChemR23/CAMKK2/AMPK这一信号通路实现。　　材料与方法：　　1.对P10新生S D大鼠使用右侧颈总动脉离断术后放入温箱进行2.5h的低氧暴露，构建新生儿H I模型。通过免疫荧光和W B技术检测H I Oh,6h,12h,24h,72h内源性 Chemerin, ChemR23, CCRL2和GPR1在患侧脑组织中的表达情况。　　2.构建H I模型后l h通过鼻腔注射不同浓度的rh-Chemerin，检测不同浓度的rh-Chemerin治疗方法对于H I继发短期(H I24h)神经功能损伤的作用；通过,3,5-三苯基氯化四氮挫(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)染色检测不同干预后24 h脑组织梗死面积情况；使用Fluoro Jade C、转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记(Transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling,TUNEL)以及免疫荧光等检测不同干预后24h神经元凋亡情况；使用4-轻基壬稀醛(4-Hydroxynonenal,4-HNE)和溴乙非唆(Ethidium, DHE)染色检测不同干预后24h活性氧(Reactive oxygen species, ROS)产生情况;通过水迷宫、foot-fault和rotarod分析rh-Chemerin对于H I继发长期(H I4周)认知和运动功能障碍的作用；通过N issl染色检测HI4周后各组新生大鼠脑组织缺失情况。　　3.将ChemR23 siRNA在构建H I模型前24h内立体定向微量泵入新生大鼠的右侧脑室内，或者在构建H I模型后30m通过腹腔注射特异性ChemR23/CAMKK2/AMPK抑制剂。通过 WB等检测 Chemerin/ChemR23/ CAMKK2/AMPK/Nrf2以及促凋亡因子，如 Cleaved Caspase3/Caspase3和Bax的蛋白含量。　　结果：　　一内源性Chemerin及其相关受体在H IE模型中的表达情况　　1.免疫荧光结果提示内源性Chemerin和ChemR23均与神经元有共表达现象，且Vehicle和rh-Chemerin组的Chemerin和 ChemR23的荧光强度较Sham组强。　　2.内源性Chemerin的表达水平在HI12h明显上调(p<0.05)，上升趋势一直持续至HI72h。内源性ChemR23的表达水平在HI24h明显上调(p<0.05)，上升趋势一直持续至HI72h。Chemerin的另两个配体， CCRL2和 GPR1的表达水平在H I后各时间点的差异均没有统计学意义。　　二 Rh-Chemerin对H I后神经功能学评分和组织形态学的影响1.与Vehicle组比较，鼻腔注射三种浓度的rh-Chemerin组在H I24h的状态明显好转：在righting reflex和negative geotaxis中所花费的时间均显著下降(p<0.05)，其中在righting reflex实验中，中等浓度(9pg/kg) rh-Chemerin组与Sham组相比较无统计学差异。HI24h体重分析显示与 Vehicle组相比较，三种浓度rh-Chemerin组的体重明显增加(p<0.05)，其中9ng/kg rh-Chemerin组与Sham组相比较无统计学差异。　　2.与Vehicle组相比较，rh-Chemerin能够显著改善H I28 d的神经功能损伤：在水迷宫实验中，寻找到目标平台游行的距离更短(p<0.05)，花费的时间更少(p<0.05)，在目标区域的时间更长(p<0.05);在foot-fault实验中，左侧肢体错步的次数明显下降(p<0.05)；在rotarod实验中，不论是在5还是lOrpm，在转轮上停留的时间显著增长（p<0.05)o　　3. Nissl染色发现与Vehicle组相比较，rh-Chemerin显著改善HI28d后出现的脑组织缺失和重量下降情况(p<0.05)。　　三 Rh-Chemerin对H I24 h后神经元凋亡和氧化应激反应的影响　　1.与 Sham组相比较，Vehicle组的脑组织中Cleaved Caspase3、Caspase3和B ax的含量在HI24h时出现显著增加(p<0.05)。与Vehicle组相比较，rh-Chemerin可明显减少上述调亡因子的含量(p<0.05)，而这种抑制作用可被ChemR23 siR N A逆转(p<0.05)。与此同时，经WB验证，ChemR23siRNA对内源性ChemR23有较好的沉默效果，使蛋白表达量显著减低(p<0.05)。　　2.与 Sham组相比较，Vehicle组的梗死周围脑组织的Fluoro Jade C+和 TUNEL+神经元数量显著增加(p<0.05)。与Vehicle组相比较， rh-Chemerin组上述阳性细胞数明显下降(p<0.05)，并且这种抑制作用能被ChemR23 siRNA逆转(p<0.05)。既往研究提示海马CA1区的神经元凋亡与认知功能的缺失密切相关。免疫荧光显示与Vehicle组相比较，rh-Chemerin可明显减少海马C A1区Fluoro Jade C+神经元。　　3.与 Sham组相比较，Vehicle组的梗死周围脑组织的DHE+和4-HNE+神经元数量显著增加(p<0.05)。与 V ehicle组相比较， rh-Chemerin组上述阳性细胞数明显下降(p<0.05)，并且这种抑制作用能被ChemR23 siRNA逆转(p<0.05)。　　四 Rh-Chemerin抑制H I神经元调亡的机制研究　　1.内源性p-CAMKK2/CAMKK2， p-AMPK/AMPK以及Nr￡2的表达水平在H I24 h明显上调(p<0.05)。这些上升趋势在rh-Chemerin组更加明显(p<0.05)，并且ChemR23 s iR N A可逆转这些上升趋势，提示CAMKK2/AM PK/Nrf2可能参与了 Chemerin/ChemR23抑制凋亡因子产生的过程。　　2.腹腔注射 Alpha-NETA， STO-609和 Dorsomorphin并不影响ChemR23的表达量。与rh-Chemerin组相比较，Alpha-NETA和ST0609组的 P-CAMKK2含量显著下降(p<0.05)，但 Dorsomorphin组的P-CAMKK2含量无统计学差异。与 rh-Chemerin组相比较， Alpha-NETA, STO-609和Dorsomorphin组的p-AMPK和Nrf2含量显著下降(p<0.05)。与rh-Chemerin组相比较，三组抑制剂均能显著地增加调亡因子，如Cleaved Caspase3/Caspase3和Bax的表达量(p<0.05)。　　3. T T C染色显示ChemR23 s iR N A以及特异性抑制ChemR2 CAMKK2/AMPK明显逆转rh-Chemerin的神经保护作用，其表现为明显增加的梗死面积（p<0.05)。此外，与rh-Chemerin组相比较，上述四种干预均导致显著的体重下降（p<0.05)。　　结论：　　研究发现rh-Chemerin能显著改善H I后短期和长期神经功能障碍，抑制神经元凋亡和氧化应激反应等保护效应，而这一保护效应是通过CAMKK2/AMPK/Nrf2信号通路实现的。该研究为新生儿H I后神经元凋亡和神经功能障碍提供了新方向。