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生物膜是微生物在环境中生存的主要存在形式之一,在生物地球化学循环中扮演着重要角色。当细菌生物膜在金属基管道材料上大量定殖,特别是当自来水流经这些管道时,其污染对公共卫生构成严重威胁。然而,人们对这种微生物生长形式的许多过程仍然知之甚少。包括在不同基底上的生长机制、应激策略和遗传信息的水平转移等方面的研究也并不多。生物膜细菌进化和快速适应环境的驱动力是什么?想要充分了解和解释生物膜形成和耐药基因扩散的机理,我们需要更好地了解这一形成过程的生物化学和分子生物学机制。本文主要选取四种不同金属材料,不锈钢（Stainless steel sheet,SS）、钛片（Titanium sheet,Ti）、铜片（Copper sheet,Cu）和泡沫镍（Nickel Foam,Ni）作为生物膜的生长基底,以大肠杆菌作为研究对象,在流动式生物膜反应器中培养生物膜。在材料生物膜形成过程中,我们从细菌生理生化水平、蛋白质水平和分子水平等方面探究了生物膜成膜的响应机制。对比了含有单耐药基因的耐药菌与敏感菌形成生物膜的应激能力差异,同时建立了简单混合生物膜体系,探究了膜内细菌结构和耐药基因水平转移效率的变化,最终阐明了生物膜在金属基底上的形成机理和膜内耐药基因的传播扩散行为等。主要研究内容和结果包括:（1）敏感细菌（Escherichia coli K-12）在金属基底材料上的生长成膜机理,从生理形态变化、胞外聚合物质分泌特征、生物膜应激系统中酶活性变化及其应激基因表达、生物膜分子调控网络四个层次进行分析。结果表明细菌以浮游形式直接接触Cu和Ni基底表面时,它们的活性急剧下降。这具体地表现为,与SS和Ti基底相比,细菌数量在24 h内减少了4.0～5.0 logs;细胞形态缩小,长度变短;胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substance,EPS）中碳水化合物含量突然增加了64倍;细菌体内氧化还原平衡在一定程度上被破坏,铜基上的细菌防御最活跃、最激烈,其次是Ni、SS和Ti;铜片上细菌体内的氧化应激系统迅速响应,所有氧化应激基因和金属转运蛋白基因都出现上调,上调幅度达到2～11倍（SS和Ti上调1～2倍,Ni上调2～9倍）。细菌可以迅速适应SS和Ti基底形成生物膜,而Cu和Ni基底幸存的细菌也会聚集形成生物膜,保护内部细胞免受不利基底环境的伤害。所有这些行为都是在生物膜调控分子网络下进行的。（2）耐药菌（Escherichia coli DH5α（CTX））在铁基和铜基底上的生长成膜机理,进一步探究与敏感细菌应激策略对比下,耐药细菌应对铜离子毒性胁迫的特殊应激机制。结果表明,铁基底上耐药菌的生物膜的生长相对敏感菌较快。而铜片上这两种菌株的丰度都出现一定程度的下降,这表明无论细菌是否具有耐药性,细菌都是收到了铜基底的损伤而使得部分细菌在成膜的过程中被杀灭了。不同的是敏感菌的衰减相对较快,在3 d内下降了4.5 logs;敏感菌在铜片上分泌的EPS在48 h内升高到940.0μg m L-1,其中总碳水化合物是蛋白质的24倍。而耐药菌分泌的EPS含量则是缓慢升高,48 h内升高到694.0μg m L-1。这说明敏感菌的损伤可能更为严重,而耐药菌则更能抵抗铜基底的毒性胁迫。进一步的探究铜片上耐药菌和敏感菌的抗氧化系统响应,发现耐药菌生物膜的抗氧化酶活性没有敏感菌波动大;氧化应激基因和金属转运蛋白基因也是敏感菌上调最显著。在生物膜成熟期,耐药菌生物膜基因的表达水平总体低于易感菌。耐药菌应对铜的氧化胁迫的能力明显比敏感菌强,说明耐药菌因具有耐药性而比敏感菌更具耐受性。（3）探究混合菌生物膜在铁基材料上的生长成膜及其膜内耐药基因的扩散。选取易感菌（Escherichia coli K-12）和耐药细菌（Escherichia coli RK2）的混合体系以及耐药细菌（Escherichia coli RK2、Escherichia coli C600（Sm））的混合体系,对比两种混合体系下的生物成膜活性、结构组成及基因转移效率等。结果表明:对比单一细菌形成的生物膜,混合细菌的生长速率更快且丰度更高。敏感菌和耐药菌的混合细菌丰度在48 h内达到最大值4.170×1010CFU m L-1,混合耐药菌同样也在48 h达到最大丰度7.760×1010CFU m L-1。两种耐药菌混合形成生物膜生长较敏感菌与耐药菌混合生物膜生长稳定,且生物膜细菌丰度多,生物膜厚度大。在敏感菌和耐药菌的混合体系中,培养过程中敏感菌逐渐增加,第4d时占所有细菌的85%,成为主要的菌种。混合耐药菌体系中受体菌的比例较稳定,在40%～50%之间。细菌之间的结构组成发生变化,种间可能存在竞争合作关系。接合转移频率结果表明:生物膜生长过程中膜内细菌的接合转移频率显著提高,特别是在生物膜成熟期,接合转移率达到最高,特别是混合耐药菌体系接合转移率提高100倍。混合生物膜内细菌接合转移机制相关基因上调和膜调控基因表达增加,进一步说明这两个过程是相互促进的。综上所述,本研究分别探索了单一细菌和混合细菌在金属基底上的形成生物膜的生长机理以及生物膜内耐药细菌耐药基因的传播扩散机制。实验发现细菌生物膜在遇到不同金属基底材料时可能有不同的应激策略;而且耐药菌形成生物膜的应激响应与普通细菌形成生物膜的应激不同,耐药菌更快适应环境的刺激。混合生物膜内耐药菌与普通菌可以共存并可能存在竞争合作关系,膜内耐药基因的转移效率显著提高。整体而言,本论文的研究可为以后其相关研究中全面探索生物膜的生长及其应激策略提供研究思路。同时,本论文研究了细菌在不同金属基底材料形成生物膜的定殖和膜内耐药基因的扩散问题,提出了生物膜细菌在自来水输送管道中的可能形成机制及其耐药性的扩散,从而可能会危害水体环境及期公共卫生健康。