论文部分内容阅读
背景香连丸源于《太平惠民和剂局方》,是治疗痢疾的经典名方,在临床上广泛用于湿热痢疾等胃肠道疾病。2015版《中国药典》中记载香连丸由萸黄连和木香细粉按4:1配伍得到。香连丸由于用药体积较大,患者服用顺应性差,因此其临床应用受限。“浓缩香连丸”和“香连片”虽在用药体积上有一定程度的缩小,但仍有提升改进空间,且提取技术也值得进一步优化。同时,香连丸的安全性资料尚不完善,系统研究较少。虽然香连丸常用于肠道疾病,但对5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）诱导的化疗腹泻未见报道。因此本文对香连丸有效成分（主要为萸黄连）的提取工艺进行了优化,并对香连丸有效成分的急性毒性、长期毒性进行了初步研究。在此基础上,进一步探讨了香连丸有效成分对5-FU诱导的化疗性腹泻的影响。目的优化香连丸中萸黄连生物碱的提取工艺,并对香连丸有效成分进行初步安全性评价,为香连丸临床用药提供科学依据;探讨香连丸有效成分对5-FU诱导的化疗性腹泻的改善作用及肠道微生物的调节作用,为扩大香连丸临床适应症提供理论基础。方法1.香连丸中萸黄连提取工艺优化基于单因素试验结果,用乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取温度作为影响因素,萸黄连总生物碱提取得率作为评价指标,利用Box-Behnken响应面法设计优化萸黄连提取工艺.2.香连丸有效成分的制备及含量测定香连丸有效成分由萸黄连浸膏和木香浸膏按照香连丸的组成比例（4:1）混合,冻干即得（其中萸黄连浸膏按上述最佳工艺提取,木香浸膏由课题组另一同学提供）。高效液相法测定香连丸有效成分中小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱、木香烃内酯和去氢木香内酯的含量,实验条件:流动相为乙腈（A）-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（B）,梯度洗脱（0-15 min,30%A;15-40 min,70%A）,检测波长为225 nm。3.香连丸有效成分急性毒性试验昆明小鼠,70只,雌雄各半,体重20±2 g,根据预实验结果,随机分为7组,分别为正常对照组及香连丸有效成分(2.00、2.66、3.54、4.71、6.26和8.32 g·kg-1)组,24 h内一次性灌胃对应剂量药物,观察14天,记录急性毒性反应及死亡情况,观察主要脏器的大体形态学和组织形态学变化,最后计算脏器系数和半数致死量(LD50)。4.香连丸有效成分长期毒性试验SD大鼠,80只,雌雄各半,体重200±20 g,随机分为4组,正常对照组及香连丸有效成分(0.4、0.8和1.6 g·kg-1)组,香连丸组灌胃对应剂量药物,正常对照组灌胃等体积生理盐水,连续给药12周,可逆性观察2周。观察并记录给药期和恢复期大鼠的外观形态、体重及饮食变化。实验结束后,麻醉大鼠,腹主动脉取血,观察主要脏器的大体形态学和组织病理学变化,计算脏器指数,检测并分析血常规和血生化等指标。5.香连丸有效成分对化疗腹泻小鼠的治疗作用化疗腹泻小鼠模型:昆明小鼠,雄性,体重20±2 g,50 g·kg-1的5-FU连续腹腔注射5天,观察并记录其腹泻评分、体重和饮食饮水等变化,腹泻评分大于1认为造模成功。造模成功后,根据随机数字表将造模小鼠随机分为模型组、盐酸洛哌丁胺胶囊(Loperamide hydrochloride capsules,LHC,0.6 mg·kg-1)组、香连丸有效成分(0.1、0.2和0.4 g·kg-1)组,正常组和模型组小鼠灌胃等体积的生理盐水,连续给药7天。观察记录并分析以下指标:（1）基础指标:每天记录所有小鼠的体重、腹泻评分、饮食和饮水等基本体征情况。（2）结肠的形态学:观察结肠外观并进行组织病理学检测。（3）炎症指标:用ELISA法检测血清和结肠中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。（4）氧化应激指标:用试剂盒检测血清和结肠中NO、SOD、GSH和MDA的含量。（5）肠道菌群:利用16S r DNA扩增子测序技术,分析粪便样本中肠道菌群的变化。（6）短链脂肪酸的测定:利用GC/MS技术,测定各组小鼠粪便中短链脂肪酸的含量。结果1.香连丸中萸黄连的最佳提取工艺香连丸中萸黄连总生物碱最佳提取工艺为:乙醇体积分数70%,提取时间2h,液料比11:1,提取温度82℃,提取2次,该工艺下得到萸黄连总生物碱提取得率为11.19%,与预测值11.23%的偏差仅为0.04%。2.香连丸有效成分中各成分含量高效液相色谱法测定的自制香连丸有效成分中表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱、木香烃内酯和去氢木香内酯的含量依次为4.29%、4.99%、4.14%、18.32%、0.59%和0.87%,总含量为33.2%,显著高于药典标准。3.香连丸有效成分急性毒性试验结果（1）预实验:找到香连丸有效成分的Dm为8.2 g·kg-1,Dn为2 g·kg-1;（2）急性毒性实验:香连丸有效成分小鼠LD50为3.712 g·kg-1,其95%置信区间为3.145g·kg-1≤LD50≤4.338 g·kg-1。不同剂量的香连丸有效成分单次给药后,4 h内,8.32g·kg-1组小鼠全部死亡,解剖后发现,与正常组相比,死亡小鼠肺的脏器系数显著升高（P<0.01）,组织病理学观察发现,死亡小鼠的肺组织部分肺泡腔实变,腔内具有大量炎性细胞浸润,伴有局灶性肺出血;肝组织肝索不清,伴有炎性细胞浸润。4.香连丸有效成分长期毒性试验结果实验结束未见动物死亡。与正常组相比,香连丸有效成分(0.4、0.8和1.6 g·kg-1)组大鼠在各个时间点的摄食、饮水和体重变化均无显著性差异（P>0.05）;PLT、HCB、HCT和Lymph%升高,Mon%、Gran%降低,其余血常规和血生化指标和脏器系数均无显著性差异（P>0.05）,组织病理学检查发现,1.6 g·kg-1组部分大鼠肺组织结构不明显、肺泡壁血管充血、肺泡腔实变、局部伴有大量炎性细胞浸润;肝组织中出现肝细胞大片坏死,周边部残存的肝细胞水肿,并且肝小叶内炎细胞呈造性浸润。5.香连丸有效成分对化疗腹泻小鼠的改善作用造模5天后,与正常组相比,模型小鼠体重减轻,饮食减少,饮水增加,腹泻评分均大于1。给药7天后,与模型相相比,香连丸有效成分组及洛哌丁胺组的小鼠具有以下改善:（1）基础指标:小鼠体重逐渐回升,腹泻指数逐渐减小或至零,饮食增加,饮水减少,自主活动变多（P<0.05）。（2）脏器系数:香连丸有效成分组及洛哌丁胺组显著提高模型小鼠的免疫器官（脾、胸腺）指数（P<0.05）。（3）结肠的组织病理学:香连丸有效成分组及洛哌丁胺组能显著增加结肠长度,并对5-FU所致的结肠损伤有不同程度的修复作用。（4）炎症指标:结肠组织中,香连丸有效成分组及洛哌丁胺组能显著减少炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的产生（P<0.05）;但在血清中无显著性差异。（5）氧化应激指标:结肠组织中,香连丸有效成分组及洛哌丁胺组能不同程度升高NO、SOD和GSH的表达,降低MDA的表达（P<0.05）;在血清中,香连丸有效成分组能升高NO和降低MDA的表达（P<0.05）,对SOD和GSH的表达无明显影响（P>0.05）。（6）肠道菌群的改变:与正常组相比,模型组小鼠粪便中总OTU的数目增加,香连丸有效成分0.4g·kg-1组和洛哌丁胺能显著减少总OTU的数目（P<0.05）;Alpha多样性（Chao、ACE、Shannon和Simpson）和β多样性（PCA、PCo A和NMDS）从不同角度说明,5-FU造模严重影响了小鼠肠道微生物的平衡,而香连丸有效成分和洛哌丁胺治疗后,小鼠肠道菌群整体结构接近正常组。从直方图和聚类热图分析不同水平下肠道菌群的相对丰度发现,模型组中变形菌含量增加,而给药后能有效抑制变形菌的增加,并降低厚壁菌/拟杆菌（Fimicutes/Bacteroidetes,F/B）的比值。（7）短链脂肪酸的含量:香连丸有效成分组能显著提升短链脂肪酸含量（P<0.05）,且效果优于洛哌丁胺。结论1.Box-Behnken响应面法能较为准确地优选萸黄连总生物碱提取工艺,提高生物碱的提取得率,减少入药体积,提取工艺方法可靠且精密度高,适用于扩大生产。2.香连丸有效成分为低毒级别,长期大剂量服用对肝脏和肺脏均有一定损害。3.香连丸有效成分能有效改善5-FU引起化疗性腹泻,其分子机制有待进一步研究。