烟粉虱Bemisia tabaci广泛分布于各大洲的多个国家和地区,自20世纪80年代后期,具入侵性的烟粉虱Middle East-Asia Minor1(MEAM1)隐种(该隐种近年来通称为B型烟粉虱)开始在多个国家和地区棉花、西葫芦、甘蓝等蔬菜及一品红等作物上暴发成灾,造成巨大损失。MEAM1隐种的入侵扩张往往又伴随着双生病毒的蔓延成灾及新双生病毒的出现,烟粉虱-双生病毒间的互惠共生很可能在双生病毒的流行及烟粉虱的迅速扩张中起了重要作用。为深入了解烟粉虱与双生病毒间互惠共生产生的机制以及这种关系在外来烟粉虱入侵中的作用,本研究以烟粉虱MEAM1隐种-中国番茄黄曲叶病毒(Tomatoyellow leafcurl China virus,TYLCCNV)-烟草为模式系统,筛选MEAM1隐种在带毒和健康烟草上取食后的差异表达基因,并结合分子生物学方法对相关基因展开研究,尝试从分子水平探讨此模式系统中产生的互惠共生现象的内在机制,为烟粉虱及其传播的双生病毒的防治提供理论基础。本研究的结果如下:　　 (1)MEAM1隐种取食健康和带毒烟草后虫体内的差异表达基因　　 以烟粉虱MEAM1隐种-TYLCCNV-烟草为模式系统,采用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)方法进行双向筛选,得到MEAM1隐种在TYLCCNV侵染烟草上取食后的124个上调的表达序列标签(ESTs)(正向文库,Forward library)及112个下调ESTs(反向文库,Reverse library)。将正反向文库中的ESTs和GenBank中的序列进行同源性分析比对,发现多个基因可能与双生病毒-烟粉虱之间的直接互作相关。如正向文库中的26／29 kDa蛋白水解酶、类肝素硫酸蛋白聚糖(laeparan sulfate proteoglycan,HSPG)、烟粉虱次生共生菌立克次氏体及铜锌超氧化物歧化酶(copper／zinc superoxide dismutase,CuZnSOD)。结合先前的研究报道,推测26／29 kDa蛋白水解酶可能参与并协助清除烟粉虱体内的病毒粒子；HSPG基因的上调也可能有助于TYLCCNV成功侵入烟粉虱细胞；次生共生菌立克次氏体相关基因的上调则可能与烟粉虱应对TYLCCNV染产生的防御反应相关。同时,实验结果表明,烟粉虱取食带毒烟草后,其体内的CuZnSOD基因表达上调,推测产生的机制可能是双生病毒进入MEAM1后,虫体内的活性氧增加,激活了机体的抗氧化系统应对病毒侵染。鉴于SOD在生物体抗氧化胁迫中的重要作用,结合本研究的结果及实验室在烟粉虱抗氧化酶和双生病毒侵染关系方面的前期工作基础,本课题的后续工作选择了烟粉虱的CuZnSOD基因做进一步研究。　　 (2)烟粉虱CuZnSOD(Bt-CuZnSOD)的克隆、表达、纯化及虫体酶活测定　　 为从分子水平深入了解SOD在烟粉虱-双生病毒及烟草互作中可能的积极作用,本实验克隆、表达并纯化了MEAM1体内的CuZnSOD,测定了纯化后Bt-CuZnSOD蛋白的酶活热稳定性,同时研究了在高低温胁迫下MEAM1体内Bt-CuZnSOD酶活的相应变化情况。实验首先通过Rapid Amplification of cDNAEnds(RACE)技术获得Bt-CuZnSOD的cDNA全长,并与其它多个物种的CuZnSOD比较后明确其具备典型的CuZnSOD特征:四个铜结合位点,四个锌结合位点,两个与二硫键形成相关的半胱氨酸及两个铜锌信号位点。利用各个物种CuZnSOD序列构建的系统发育树表明Bt-CuZnSOD为胞内CuZnSOD。同时,使用GST融合蛋白表达系统成功对目的基因进行原核表达与纯化,最终得到纯化的Bt-CuZnSOD蛋白并通过检测证明了其活性。最后,实验设置了高低温处理条件,并明确在高温和低温胁迫条件下虫体内Bt-CuZnSOD的活性都显著上升。推测入侵亚热带地区的MEAM1能在极端温度下正常生存,可能与其体内CuZnSOD能高效去除高温环境下产生的过多氧自由基密切相关。　　 本研究结果明确了TYLCCNV可通过直接或间接方式对带毒烟草上取食的烟粉虱体内基因产生显著影响,同时克隆并利用原核表达系统在体外成功表达了烟粉虱CuZnSOD基因,并获得纯化后具活性的Bt-CuZnSOD蛋白,且初步研究了其在逆境胁迫下的生理功能。推测在烟粉虱-双生病毒-烟草三者互作过程中,MEAM1隐种基因表达谱的变化可能对烟粉虱的生殖力和存活率等生物学特征产生积极作用,从而产生互惠共生现象。本实验研究结果对于深入探讨双生病毒与烟粉虱间的互惠共生现象的分子机制有重要的理论价值。