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背景:白术为常用健脾益气中药之一,具有健脾益气,燥湿利水,止汗安胎之功效,可用于脾虚食少,腹胀泄泻,痰饮眩悸、水肿、自汗、胎动不安等病证的治疗。临床以白术为主组成的方剂较多用于胃肠疾病的治疗。近代临床和药理研究均表明白术具有明显的胃肠黏膜保护作用,其有效提取部位能促进小肠上皮细胞的增殖、分化和迁移,而另有研究表示白术多糖对小肠上皮细胞有增殖抑制作用。在临床健脾益气方中白术和甘草常一起配伍使用,且甘草对多种以粘膜损伤为特征的疾病和病理状态具有治疗作用。在实验室的前期研究工作中发现甘草可通过促进 DFMO诱导的生长抑制模型的IEC-6细胞的增殖,对肠粘膜上皮起保护作用。且该研究证明甘草能通过下调p53、p21mRNA及其蛋白的表达,起促细胞增殖作用。因此,本论文研究白术与甘草配伍对DFMO模型IEC-6细胞增殖及其p53、p21mRNA和蛋白表达的影响,探讨其配伍作用与单独药物作用的区别。为白术健脾作用在临床的运用提供实验依据。 目的: 1.研究白术对IEC-6细胞和DFMO模型IEC-6细胞增殖的影响; 2.研究白术与甘草配伍对DFMO模型IEC-6细胞增殖的影响; 3.研究白术及其与甘草配伍对DFMO模型IEC-6细胞p21、p53mRNA和蛋白表达水平的影响。 方法: 1.细胞模型和用药:以IEC-6细胞和DFMO诱导的生长抑制IEC-6细胞为模型细胞。实验所用白术和甘草均为中药配方颗粒,购买于江阴天江药业有限公司,批号分别为:1008144和1102021。 2.白术对细胞增殖作用的检测:采用MTT法检测细胞活性和基于流式细胞术的CFSE标记检测细胞分裂速度以及PI染色检测细胞周期分布三种方法,研究白术及其与甘草配伍对IEC-6细胞和DFMO诱导IEC-6细胞增殖的影响并确定有效作用时间和剂量范围。 3.白术对IEC-6细胞p53、p21mRNA和蛋白表达影响的检测:利用qRT-PCR技术和Western Blot蛋白免疫印迹技术,分别检测白术及其与甘草配伍对不同模型IEC-6细胞p53、p21mRNA和蛋白表达水平的影响。 结果: 1.白术颗粒剂量(AM108μg/mL和 AM216μg/mL)在加药处理24h和48h内对IEC-6细胞的增殖无明显影响,而白术颗粒(AM432μg/mL和AM2160μg/mL)在作用细胞48h后对细胞的增殖具有显著的抑制作用,但在加药处理72h后,各剂量组白术颗粒均能显著抑制IEC-6细胞的增殖。其抑制作用与p21mRNA及其蛋白表达水平的增加有关; 2.白术颗粒对DFMO诱导IEC-6细胞的增殖未见明显影响,但实验所用剂量白术颗粒可上调DFMO诱导IEC-6细胞p53、p21mRNA和蛋白的表达水平; 3.白术颗粒与甘草颗粒不同比例配伍均能显著下调单独白术颗粒作用对DFMO模型IEC-6细胞p53、p21mRNA和蛋白表达的影响,促进IEC-6细胞的增殖。 结论:本实验所选用剂量白术颗粒对 IEC-6细胞的增殖具有显著的抑制作用,进一步的研究表明该抑制作用与白术颗粒在转录水平以及蛋白水平上调周期抑制蛋白p21的表达有关,且其对p21mRNA及蛋白表达的调控为非p53依赖途径;而对于DFMO模型IEC-6细胞,甘草颗粒与白术颗粒配伍使用,可显著下调单独白术颗粒作用所诱导的p53、p21mRNA和蛋白的表达水平,表明在此细胞模型中配伍用药甘草能调和白术的药性,降低其对IEC-6细胞增殖的影响。