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随着现在生物能源产业转入非粮时代,纤维素、半纤维素利用问题是解决原料成本上的一个技术难题,纤维素预处理以及水解产物中木糖等五碳糖的利用问题是其中的关键,利用分子生物学技术手段,拓展传统油脂微生物的木糖利用效率,以最终实现木质纤维素为原料发酵生产微生物油脂,是随着生物柴油技术成熟推广应用而备受关注的问题。
本课题主要研究了产油酵母—粘红酵母木糖利用过程中介导五碳糖特异性跨膜转运的机理研究。首先,本文考察了已报道的假丝酵母木糖特异性跨膜转运蛋白在粘红酵母中的表达,实验中首先构建了适用于粘红酵母外源基因表达用的质粒载体,在原有质粒基础上添加了适用于粘红酵母基因工程筛选用的博来霉素抗性基因(shble),同时添加了适用于粘红酵母表达外源基因的多克隆位点,构建了粘红酵母游离型表达载体PRS424-Phxt7-GFP-Thxt7-shble,对于粘红酵母后期整个分子生物学的研究具有很强的应用价值。
在构建好的载体PRS424-Phxt7-GFP-Thxt7-shble上成功的连接了已报道的假丝酵母木糖特异性跨膜转运基因GXS1(GlucoseXylose Symporter),通过对原始菌与重组菌木糖发酵过程中对木糖浓度的测定,发现重组菌对木糖的吸收利用效率高于原始菌,重组菌在发酵80小时左右木糖消耗完,同比原始菌则需要在120h左右才能将木糖利用完。说明重组菌中表达的木糖跨膜转运蛋白能够有效地介导木糖的胞外到胞内的运输。
本文尝试凭借反转录PCR技术,染色体步移技术,RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术同时借助已报道的同源特异性木糖跨膜转运蛋白序列钓取粘红酵母特异性的木糖跨膜转运基因,克隆得到了1513bp的粘红酵母木糖跨膜转运基因的核心序列,经NCBI同源比对分析与已报道的假丝酵母特异性木糖跨膜转运基因相似性为83%,为克隆该基因cDNA全长以及功能的分析研究奠定了基础。