研究背景近年来,随着苹果型肥胖人群及代谢综合征人数的增加,非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的发病率也逐年上升。目前,在西方国家NAFLD的发病率大约是20%～30%,在亚洲的发病率为5-18%,我国的发病率为15%～40%,是目前最常见的肝脏慢性疾病,且是近十年来唯一发病率逐年上升的一类肝脏疾病,过去十年中NAFLD相关肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)的发病率增长了 3～10倍,严重威胁人类健康,造成了巨大的社会和医疗负担。据预测,到2030年NAFLD发病率将增至33.5%,成为终末期肝病和肝移植治疗的主要病因。因此,发现参与NAFLD病理过程的重要分子机制和诊疗靶标、实现患者在早期阶段的动态监测和有效干预是临床和基础研究面临的重大问题。从疾病进程上,NAFLD可分为非酒精性单纯性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)以及相关肝硬化和 HCC。NAFLD的发病机制复杂,而甘油三脂(TG)在肝细胞中的积累是整个过程的始动因素。之后由于脂质的过氧化作用产生脂毒性,形成内质网氧化应激,进一步激活炎症信号通路,加重疾病的进展。已有研究已显示,脂肪酸(FattyAcid,FA)代谢途径的紊乱,即脂肪酸摄取、合成和利用的失衡,是导致TG在肝细胞中累积的内在机制。已知众多代谢酶和相关转录因子、调控分子在维持肝细胞脂代谢稳态中发挥重要作用,其中能够结合并感知不同种类脂肪酸的蛋白家族(如脂肪酸结合蛋白FABPs,过氧化物酶体增殖剂激活受体家族PPARs)是倍受关注、研究较深入的一类分子。这类分子表达的异常会导致肝细胞中脂肪酸代谢途径紊乱,是介导NAFLD发生发展的重要机制之一。基于脂肪酸结合蛋白开发的相应激动剂或抑制剂已经进入临床试验,用于NAFLD治疗。因此,发现新的脂肪酸感应分子,揭示其感知脂肪酸、调控脂代谢稳态的分子网络对于阐明NAFLD发生机制、寻找新的治疗靶点具有重要意义。肿瘤坏死因子α诱导的蛋白8(TNFα-inducedprotein 8,TIPE)家族是新近被鉴定的、具有脂质结合活性的蛋白家族。该家族中TIPE,TIPE1,TIPE2和TIPE3四个成员,各成员在氨基酸序列和蛋白结构上具有高度同源性。晶体结构分析显示,TIPE、TIPE2和TIPE3蛋白均包含由多个α螺旋围绕构成的中央疏水性空腔结构,可容纳脂类分子,并通过介导脂类分子(磷脂酰肌醇二磷酸PIP2、磷脂酰肌醇三磷酸PIP3)的转位或形成蛋白-脂类复合体(磷脂酰乙醇胺PE),调控下游信号通路,进而调节细胞生长、死亡和趋化等重要生物学过程。以上研究强烈提示,TIPE家族独特的蛋白结构决定了其与不同脂类分子结合的能力,而该能力是TIPE家族发挥生物学功能的重要条件。TIPE1分子属于TIPE家族一员,在2008年首次被发现可以调控细胞凋亡和坏死。在氧化应激的条件下,TIPE1能够与FBXW5结合而抑制TSC2蛋白的蛋白酶体降解途径,进而增强多巴胺神经元的自噬。2015年我们课题组前期研究发现:TIPE1在成年肝脏中呈现高丰度表达,而在肝癌组织中低表达,并通过抑制Racl的活性促进肝癌细胞死亡。亦有基因组芯片的数据显示,TIPE1在db/db小鼠心脏组织中的表达显著低于db/+小鼠,由此提示,TIPE1可能参与了代谢性疾病的发生发展过程。结合国内外研究进展和本课题组前期实验发现,我们提出假说:TIPE1可能参与肝脏代谢性疾病的发生发展过程。研究目的本课题以NAFLD为研究模型,探讨TIPE1在NAFLD发生发展中的作用及其分子机制,为NAFLD临床治疗寻找新的靶点。具体要解决的实验目的如下:1.检测TIPE1在肝细胞脂肪变中的表达变化;2.明确TIPE1在肝细胞脂肪变中的作用;3.探讨TIPE1调控肝细胞脂质代谢、参与肝脂肪变性的分子机制。研究方法与结果1.TIPE1在肝细胞脂肪变中的表达变化1.1 NAFLD小鼠模型中肝组织TIPE1表达显著下调我们首先利用高脂饮食(High-fat diet,HFD)建立小鼠NAFLD模型,利用WB和qPCR检测HFD小鼠和正常饮食的对照小鼠肝脏中TIPE1表达,结果发现TIPE1蛋白和mRNA水平的表达均较对照组明显下调;免疫荧光实验也进一步证实,HFD饮食小鼠肝细胞中TIPE1的表达下调。胆碱-蛋氨酸缺乏(Methionine-Choline-Deficient,MCD)饮食建立肝脂肪变模型也显示TIPE1在脂肪变肝组织中表达下调。上述研究提示,不同小鼠肝脂肪变模型中肝组织TIPE1表达均呈现降低的趋势。1.2体外肝细胞脂肪变模型中TIPE1表达降低利用高浓度不饱和脂肪酸-油酸(OA)以及饱和脂肪酸-棕榈酸(PA)刺激肝细胞系可诱导胞内脂质沉积,建立体外脂肪变模型。据此,课题检测了于OA或PA处理后不同的时间点收集的肝癌细胞HUH7中,TIPE1 mRNA的表达变化。qPCR检测结果显示,随刺激时间的延长,TIPE1表达量逐渐下调,且PA具有更强的抑制作用。上述结果进一步明确了 TIPE1在肝细胞脂肪变性中表达下调,初步提示TIPE1可能参与NAFLD的发生发展。2.TIPE1蛋白可缓解肝细胞脂肪变性2.1体外实验证实TIPE1可减轻肝细胞脂肪变性2.1.1 TIPE1能够缓解肝细胞脂质沉积为明确TIPE1在肝细胞脂肪变性中的作用,首先建立OA/PA刺激的体外细胞模型观察TIPE1对肝细胞脂质沉积的影响。利用TIPE1本底表达较高的HUH7细胞系,siRNA干扰TIPE1表达后,分别加入OA/PA刺激24h,油红O染色以及胞内甘油三酯(TG)含量检测均发现细胞内的脂滴沉积明显加重;同时利用本底TIPE1表达较低的HepG2细胞系,过表达pcDNA3.0-TIPE1-HA质粒,油红O染色和胞内TG含量检测均发现细胞内的脂滴沉积显著减弱,以上研究初步提示,TIPE1可参与调节肝细胞脂肪变性。2.1.2 TIPE1能够调控肝细胞脂质代谢相关基因的表达中性甘油三脂(TG)在肝脏中的过量积累是形成肝脂肪变性的主要原因,而脂肪酸的从头合成增多、自由脂肪酸进入线粒体β氧化受阻和TG运送出肝受阻均导致TG在肝中过量累积,进而诱发肝细胞脂肪变性。为了进一步验证TIPE1在肝脂肪变中的作用,利用HUH7肝癌细胞系干扰TIPE1后,qPCR及WB检测发现PPARγ、SREBP1、CD36等脂代谢调控关键基因的表达显著上调。在转染细胞中,加入OA/PA刺激,WB结果表明TIPE1干扰后PPAR Y、SREBPI、CD36、FASN基因的上调趋势更加显著。在HepG2细胞中过表达pcDNA3.0-hTIPE1-HA质粒,WB检测发现PPARγ、SREBP1、CD36表达相应下调。上述结果进一步证实,TIPE1可能通过调控脂代谢相关基因的表达参与肝细胞脂肪变性。2.2体内实验证实TIPE1能缓解NAFLD进程为了进一步明确TIPE1在肝脂肪变性中的作用,我们分别利用肝细胞特异性过表达TIPE1和肝细胞特异性敲除TIPE1进行MCD饮食和HFD饮食建立NAFLD模型,分析TIPE1在NAFLD进程中的作用。2.2.1 TIPE1过表达可减轻MCD诱导的肝脂肪变性C57BL/6小鼠分别于day1和day6尾静脉高压注射TIPE1过表达质粒pcTIPE1或空载体质粒pcDNA3.0,MCD饮食2周,每日监测体重变化,day14处死小鼠,检测血脂、肝脏脂质含量,HE染色和油红O染色观察肝细胞脂质累积,RT-PCR检测肝脏炎症因子的表达。体重变化分析发现,过表达TIPE1质粒可以有效减缓MCD饮食小鼠的体重下降率,减弱肝匀浆中脂质(TG、T-CHO、LDL-C)水平的升高和血清中的脂质水平的降低,肝组织油红O染色和HE染色结果显示TIPE1过表达可减轻肝组织中的脂质沉积,qPCR结果发现TIPE1过表达组小鼠肝脏促炎细胞因子(TNF-a和IL-1 β)的表达有降低趋势。以上结果提示,TIPE1过表达可抑制MCD诱导的NAFLD进程。2.2.2肝细胞特异性TIPE1过表达可减轻HFD诱导的脂代谢紊乱构建肝细胞特异性AAV-TBG-mTIPE1-Luc过表达腺相关病毒载体,纯化获得AAV病毒,尾静脉高压注射C57BL/6小鼠,给予HFD饮食饲喂。动物活体成像显示,AAV-TBG-TIPE1-Luc特异性表达在肝脏,体重监测发现TIPE1过表达组体重增加和血脂水平上升的程度减轻(实验仍在进行中)。2.2.3肝细胞特异性TIPE1敲除加重HFD诱导的脂代谢紊乱利用Cre-loxp系统构建肝细胞特异性TIPE1基因敲除小鼠(Alb-cre+;TIPEflox/flox)和对照小鼠(Alb-cre-;TIPE1flox/flox),给予 HFD 饮食饲喂。RT-PCR和Western blot显示敲除组小鼠肝组织中TIPE1表达显著降低,HFD饮食后敲除组小鼠血清TG水平和ALT水平显著高于对照组小鼠(实验仍在进行中)。3.TIPE1调控肝细胞脂质代谢、参与肝脂肪变性的分子机制目前,家族成员中TIPE、TIPE2和TIPE3蛋白的晶体结构已被解析,均包含由多个α螺旋围绕构成的中央疏水性空腔结构,适合容纳脂类分子。进一步实验证实,TIPE2和TIPE3可结合脂类第二信使分子(磷脂酰肌醇二磷酸PIP2、磷脂酰肌醇三磷酸PIP3),介导其转位至细胞膜,激活下游信号通路PI3K-AKT和MEK-ERK通路的活化,重塑细胞骨架、调节免疫细胞迁移至炎性部位、参与炎症反应,或调控细胞增殖、参与肿瘤的发生;而TIPE分子能够与磷脂酰乙醇胺PE形成蛋白-脂类复合体、调控mTOR通路的活化,进而抑制细胞自噬。3.1 TIPE1蛋白具有脂质结合潜力,可感知脂肪酸分子氨基酸序列分析发现,TIPE1分子与家族其他成员具有高度同源性,且蛋白质结构上具有相似性;软件预测发现,TIPE1蛋白的中央空腔结构可容纳OA分子;表面等离子共振(SPR)实验提示,TIPE1分子可高亲和力结合OA。以上结果提示,TIPE1具有脂质结合潜力,可高亲和力结合脂肪酸分子。3.2 TIPE1可结合并调控mTORC2复合体调节肝细胞脂质代谢mTOR信号通路在脂代谢中发挥重要作用,mTOR信号通路有两个重要的复合体mTORC1和mTORC2,是细胞内接受外界氨基酸及生长因子等刺激信号的重要复合体,参与调控细胞生长、凋亡、自噬、脂代谢等众多生物学过程。3.2.1 TIPE1能够与mTORC2复合体相互作用为研究TIPE1调控NAFLD的分子机制,我们在HEK293细胞转染pcDNA3.0-TIPE1-HA质粒及对照pcDNA3.0,利用HA抗体进行CO-IP实验,结果发现TIPE1能够与mTORC2复合体的mTOR、Rictor以及G β L蛋白成分结合,而与Raptor蛋白之间并无相互作用。同时,利用mTOR及Rictor的抗体进行反向CO-IP,进一步证实了 TIPE1与mTORC2复合体间的相互作用;SPR实验进一步明确TIPE1与Rictor蛋白的直接相互作用。3.2.2 OA可加强TIPE1蛋白与Rictor蛋白间的互作上述研究发现,TIPE1可容纳OA分子,且可结合mTORC2复合体,为进一步分析二者间的关系,课题利用SPR技术进行了序贯结合实验,即先后在流动相中加入OA溶液和纯化Rictor蛋白,观察OA溶液的介入对Rictor蛋白与TIPE1蛋白结合的影响。结果显示,经OA溶液预结合的TIPE1蛋白芯片,与Rictor蛋白有更高的亲和力。以上结果提示,TIPE1蛋白可通过感知脂肪酸分子,参与调控胞内信号转导通路。3.2.3 TIPE1调控mTORC2复合体表达及下游通路活化为进一步阐释TIPE1参与调控肝细胞脂质代谢的分子机制,课题研究了TIPE1对mTORC2复合体及下游信号通路活化的影响。在HUH7细胞中转染TIPE1 siRNA,检测经OA/PA刺激或未刺激对照组细胞中mTOR复合体表达及下游信号通路分子的活化情况。Western Blot结果显示,干扰TIPE1后,总Rictor蛋白、总mTOR蛋白和相应磷酸化水平均升高,AKT(ser308)和AKT(ser473)磷酸化水平亦有升高趋势。经OA或PA刺激后相关分子表达变化更加显著,而Raptor蛋白的表达和磷酸化水平未见显著差异。以上结果进一步证实,TIPE1可调控本底和脂质刺激状态下肝细胞中mTORC2复合体的表达和/或活化。3.2.4 TIPE1通过调控mTORC2通路参与肝脂肪变性前期实验结果发现,TIPE1能够调节mTORC2的下游信号分子SGK1的磷酸化水平。已有文献证实,SGK1参与调控脂质代谢。为进一步探讨,SGK1在TIPE1调控肝细胞脂肪变性中的作用,我们利用SGK1的抑制剂(GSK650394)预处理肝细胞进行拯救实验。HUH7肝癌细胞系中转染TIPE1-siRNA,加入OA刺激的同时也加入GSK650394刺激24h,利用荧光染料BODIPY进行中性脂质着色。荧光显微镜观察脂滴沉积,流式检测荧光强度,结果显示TIPE1干扰可显著增强胞内平均荧光强度,而加入GSK650394之后,TIPE1干扰促进脂滴沉积的作用显著削弱。Western Blot检测脂代谢相关基因的表达,结果显示TIPE1可上调PPARγ、CD36和FASN的表达,而SGK1抑制剂GSK650394可逆转该效应。这些结果初步提示,TIPE1可能通过调控mTORC2通路参与肝细胞脂肪变性的进程。研究结论根据以上实验结果,我们初步明确TIPEI参与非酒精性脂肪肝发生发展的分子机制,并得出以下结论。1、TIPE1在肝脂肪变模型中的表达下调;2、TIPE1能够缓解肝细胞脂肪变性;3、TIPE1可感知脂肪酸分子,调控mTORC2复合体,抑制mTOCR2下游SGK1分子参与肝脂肪变性。创新性及研究意义本课题首次检测了 TIPE1在肝脂肪变模型中的表达变化,初步研究了 TIPE1在肝脂肪变中的作用,并首次证明了 TIPE1通过调控mTORC2信号通路参与肝脂肪变的发生发展。为非酒精性脂肪肝临床治疗提供新的潜在靶点。