低温低氧复合暴露对大鼠肺微血管内皮细胞的损伤作用

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目的:研究低温、低氧单因素及低温低氧复合因素对大鼠肺微血管内皮细胞的损伤作用,阐明低温低氧复合暴露损伤与单因素暴露损伤的区别及复合暴露的主要影响因素,为进一步认识高原肺水肿的发病机理提供理论依据。方法:1.动物暴露模型:24只雄性Wistar大鼠,体质量180-200g,随机分为4组:正常对照组(n=6):25℃室温、常氧含量24h;低温组(n=6):5℃低温舱中常氧含量暴露24h低氧组(n=6):25℃室温、低氧装置中,设置氧含量为10%,低氧暴露24h;低温低氧组(n=6):5℃低温舱中放置低氧装置,氧含量为10%,低温低氧暴露24h。检测肺组织湿/干比值,病理损伤评分,测定血清中NOS、ET-1的含量,RT-PCR法检测VEGF、caspase-12的mRNA表达情况。2.细胞暴露模型:采用综合酶消化法培养大鼠肺微血管内皮细胞。分别在常温(37℃)、低温(28℃)、低氧(3%O2)、低温低氧(28℃3%O2)培养箱中培养24h。MTT法检测细胞存活率,试剂盒检测LDH活力、SOD活力以及MDA含量、硝酸还原酶法检测一氧化氮(NO)的释放、RT-PCR法检测血管内皮生长因子(VEGF)、内皮素-1(ET-1)、细胞间粘附因子-1(ICAM-1)、IL-1β、IL-6、TNF-α、caspase-12的基因表达水平,Hoechst33258和TUNEL法检测细胞凋亡。用析因分析的方法,阐明复合损伤与单因素损伤的区别,有无交互作用。结果:1.动物暴露模型:低温、低氧单因素和低温低氧复合因素均使肺组织的含水量增加,肺组织出现实质性损伤,血清中NOS含量减少而ET-1含量增加,VEGF、caspase-12的mRNA表达水平上调。低温和低氧两因素在以上对肺组织的损伤及功能改变方面存在正交互作用。2.细胞暴露模型:原代培养的大鼠肺微血管内皮细胞呈典型的鹅卵石样排列,经CD31免疫荧光染色、Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色、植物凝集素结合试验鉴定为微血管内皮细胞。与对照组相比,低温组、低氧组、低温低氧组PMVECs的细胞膜通透性增加(LDH活力增加、VEGF的mRNA表达上调)、炎性因子分泌增加(ICAM-1/IL-1β/IL-6/TNF-α的mRNA表达增加)、血管活性物质分泌失衡(NO释放减少、ET-1的mRNA表达上调)、细胞凋亡增加并且caspase-12的mRNA表达上调,而在氧化应激损伤方面,SOD的活力则表现为低温组、低温低氧组上升,低氧组下降,MDA则只表现为低氧组含量上升;低温和低氧两个因素在细胞存活率、SOD活力、MDA含量、LDH水平、NO释放量、ET-1、VEGF、ICAM-1、caspase-12mRNA表达方面都存在正交互作用(协同作用),而在炎性因子的基因表达方面则没有交互作用的存在。结论:低温低氧复合因素较单一因素对大鼠肺微血管内皮细胞的损伤更为严重,两因素的复合暴露可能是高原肺水肿发生的主要诱发因素。
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