B细胞淋巴瘤滤过性病毒插入位点1(B cell-specific MLV integration site-1,Bmi1)基因属于Polycomb基因家族成员。Bmi1对正常成体造血、神经、乳腺上皮、肠道和骨髓间充质干细胞等的自我更新起有重要的作用。Bmi1基因敲除纯合子小鼠表现为神经异常、严重的造血障碍和骨骼生长障碍及成熟前骨质疏松。虽然有报道指出淋巴细胞过表达Bmi1的EμBmi1转基因小鼠在出生时表现出椎骨发育成形的改变,但是淋巴细胞过表达Bmi1对小鼠造骨微环境的影响和对出生后骨骼发育及成骨细胞骨形成的影响至今未见报道。为了明确淋巴细胞中特异性过表达Bmi1是否能够通过改善造骨微环境,维持骨髓间充质干细胞(BM-MSC)的自我更新能力,促进其向成骨细胞分化,发挥促进骨形成的作用,我们比较分析了同窝野生型(WT)和EμBmi1小鼠的表型差异。我们首先通过实时定量逆转录聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)证明Bmi1基因和蛋白表达水平在EμBmi1小鼠胸腺、脾脏和骨髓中明显增高。Bmi1淋巴细胞过表达使小鼠体型增大、重量增加、胸腺和脾脏也明显增大。为了明确Bmi1淋巴细胞过表达对骨骼生长和骨形成的影响,我们利用X线摄影、微CT扫描及三维重建、组织学、组织化学和免疫组织化学等方法,比较分析了8周龄WT和EμBmi1小鼠的骨骼表型差异。结果发现:长骨和椎骨长度、软骨生长板宽度和增殖细胞核抗原(PCNA)阳性软骨细胞数百分比、骨密度、骨容量、成骨细胞数、碱性磷酸酶(ALP)和I型胶原(COL-I)阳性面积百分比及成骨相关基因表达水平,包括Runx2、ALP、COL-I和骨钙素(OCN)以及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性破骨细胞面在EμBmi1转基因小鼠均较同窝WT小鼠明显增加。这些结果证明Bmi1淋巴细胞过表达能够通过促进软骨内骨形成而加速骨骼生长;虽然也能够促进破骨细胞骨吸收,但促进成骨细胞骨形成作用更强,而使骨容量明显增加。为了明确Bmi1淋巴细胞过表达促进成骨细胞骨形成是否与其促进BM-MSC增殖和向成骨细胞分化有关,通过骨髓细胞体外培养、细胞化学染色及图像分析方法检测了BM-MSC增殖和向成骨细胞分化能力的变化。结果显示:甲基蓝染色阳性成纤维细胞集落形成单位(CFU-f)面积、ALP阳性CFU-f面积和茜素红染色阳性CFU-f面积百分率在EμBmi1转基因小鼠骨髓细胞培养中均较WT小鼠明显增加。继而我们发现EμBmi1转基因小鼠骨髓细胞和脾脏细胞条件培养基均能明显增加甲基蓝染色阳性CFU-f面积和ALP阳性CFU-f面积。这些结果证明Bmi1淋巴细胞过表达能够通过释放某些因子而促进BM-MSC增殖和向成骨细胞分化。为了鉴定Bmi1淋巴细胞过表达释放的促进成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收的因子,我们利用蛋白芯片检测,比较分析了8周龄WT和EμBmi1小鼠血清蛋白的表达差异。结果显示:白介素15(IL-15)、卵泡抑素样蛋白3(FLRG or FSTL3)和胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP-7)表达水平在EμBmi1转基因小鼠血清中较WT小鼠分别上调7.2倍、7.6倍和3.5倍。它们的上调在促进成骨细胞骨形成或破骨细胞骨吸收中的作用尚待研究。鉴于Bmi1缺失能够引起氧化应激增加,那么,Bmi1淋巴细胞过表达是否能够通过抑制氧化应激,而发挥促进小鼠生长发育的作用尚不清楚。为了回答这个问题,我们检测了8周龄同窝WT和EμBmi1转基因小鼠不同组织中氧化应激相关指标的变化。结果显示:与WT小鼠相比,活性氧簇(ROS)水平和丙二醛(MDA)含量在EμBmi1转基因小鼠骨髓细胞、胸腺、脾脏、肾脏组织中明显下降,而总抗氧化能力(T-AOC)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性在EμBmi1转基因小鼠骨髓细胞、胸腺、脾脏、肾脏组织和血浆中均明显升高。这些结果说明Bmi1淋巴细胞过表达能够通过提高抗氧化能力,抑制不同器官的氧化应激,从而发挥促进小鼠生长发育的作用。我们先前的研究发现甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)核定位序列(NLS)和C末端缺失(Pthrp KI)小鼠表现为Bmi1表达水平下降以及较Bmi1缺失小鼠更为严重的成熟前衰老和骨质疏松表型。为了明确淋巴细胞特异性过表达Bmi1能否纠正或改善Pthrp KI小鼠的成熟前衰老和骨质疏松的表型,我们建立了淋巴细胞过表达Bmi1的Pthrp KI(EμKI)小鼠,并比较分析了它们与WT、EμBmi1、Pthrp KI小鼠的表型差异。结果发现:与Pthrp KI小鼠相比,EμKI小鼠生存期明显延长,体重明显增加,胸腺和脾脏大小明显增大。这些结果说明Bmi1淋巴细胞过表达能够延长Pthrp KI小鼠的寿命,改善其生长发育。为了明确Bmi1淋巴细胞过表达能否纠正或改善Pthrp KI小鼠的骨骼生长阻滞和成熟前骨质疏松的表型,我们利用影像学、组织学、组织化学和免疫组织化学、Real-time RT-PCR等方法,比较分析了2周龄小鼠的骨骼表型差异。结果发现:长骨长度、软骨生长板宽度、PCNA阳性软骨细胞数百分率、骨密度、骨容量、成骨细胞数、ALP和COL-I阳性面积百分率及成骨相关基因表达水平,包括Runx2、ALP、COL-I和OCN以及TRAP阳性破骨细胞面在EμKI小鼠均较同窝Pthrp KI小鼠明显增加,但是,这些指标均未恢复到WT小鼠水平。这些结果说明Bmi1淋巴细胞过表达能够改善Pthrp KI小鼠的骨骼生长阻滞和成熟前骨质疏松的表型。为了明确Bmi1过表达改善PTHrP KI引起的成熟前骨质疏松是否与其抑制氧化应激有关,我们利用2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCF-DA)掺入和流式细胞仪检测、Real-time RT-PCR和Western blot等方法比较分析了四种基因型小鼠骨髓细胞、脾脏和胸腺细胞中ROS水平以及骨组织中抗氧化酶基因和蛋白表达水平的变化。结果显示:与Pthrp KI小鼠相比,骨髓细胞、脾脏和胸腺细胞中ROS水平在EμKI小鼠明显降低,而抗氧化酶基因包括SOD1/2/3、谷胱甘肽还原酶(GSR)和谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)表达水平以及SOD1和Sirt1蛋白表达水平在EμKI小鼠均明显上调。这些结果说明Bmi1淋巴细胞过表达能够抑制Pthrp KI引起的氧化应激增加。为了进一步明确Bmi1过表达抑制PTHrP KI引起的氧化应激增加是否也能抑制其引起的DNA损伤及其反应,我们利用免疫组织化学和Western blot等方法比较分析了四种基因型小鼠骨组织中DNA损伤相关指标的变化。结果显示:与Pthrp KI小鼠相比,磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)阳性软骨细胞百分率和蛋白表达水平及p16和p53蛋白表达水平在EμKI小鼠均明显降低,而Bmi1蛋白表达水平在EμKI小鼠明显上调。这些结果说明Bmi1淋巴细胞过表达能够抑制PTHrP KI引起的DNA损伤增加及其反应。本研究结果证明Bmi1淋巴细胞过表达能够通过促进BM-MSC增殖和向成骨细胞分化,发挥促进骨形成的作用,同时,我们还证明Bmi1淋巴细胞过表达能够通过抑制氧化应激和DNA损伤及其反应,而改善Pthrp KI小鼠成熟前衰老和骨质疏松的表型。本研究结果说明Bmi1淋巴细胞过表达能够通过改善造骨微环境,促进BM-MSC增殖和向成骨细胞分化,发挥促进骨形成的作用。此研究成果为通过改善造骨微环境防治骨质疏松这一新策略提供了理论和实验依据。