随着对环境污染物造成的人类健康和环境安全问题的重视,研究者开始将注意力转向正在使用的农药对人类和动物引起的潜在毒性作用。传统观点认为,拟除虫菊酯类农药具有广谱高效的生物活性、低的环境和食品残留度、相对较低的哺乳动物毒性。生产生活中的广泛使用使人类和生物不可避免地通过各种途径长期暴露于拟除虫菊酯中。越来越多的研究发现拟除虫菊酯能干扰生物体正常的功能,对人类和动物的健康造成相当大的威胁。作为一类重要的手性农药,拟除虫菊酯对非靶标生物的各种潜在毒性作用还存在对映体选择性。目前关于拟除虫菊酯各种潜在毒性的研究大多集中于外消旋体对生物个体或单个系统的影响,对单一对映异构体引起的毒性作用及其分子机制的研究仍然非常少见。因此,我们选取以联苯菊酯(BF)为代表的几种常用拟除虫菊酯,在不同的体内和体外模型中研究手性拟除虫菊酯类农药引起的免疫毒性、生殖内分泌干扰和肝脏损伤。利用分子生物学手段,在细胞和分子水平上探讨毒性发生的机制及对映体差异,以期对手性拟除虫菊酯的潜在毒性作用进行比较全面的评价。主要研究内容包括以下四个部分：(1)对农药等外源性化合物引起的健康风险,尤其是免疫毒性等靶器官毒性的研究主要集中于母体化合物,鲜少涉及其代谢产物。我们选用人单核细胞U937作为体外模型,通过MTT、流式细胞仪和酶联免疫实验,评价氯菊酯、右旋苯醚菊酯、氯氰菊酯、功夫菊酯和右旋苯氰菊酯及3种共同代谢产物3-phenoxybenzoic alcohol (PBCOH)、3-phenoxybenzaldehyde (PBCHO)和3-phenoxybenzoic acid (PBCOOH)的免疫细胞毒性。细胞活性和细胞凋亡的实验结果显示,5种拟除虫菊酯及其代谢产物都能对单核细胞产生细胞毒性。代谢产物中的PBCHO和PBCOOH比其他测试化合物的细胞毒性更大,在10-5mol/L时分别能将细胞活性抑制至阴性对照的56.8%和50.6%,在10-6mol/L时则分别能诱导8.52%和8.81%的细胞凋亡。拟除虫菊酯及其代谢产物对肿瘤坏死因子α(TNFa)和白介素(ILs)的分泌水平都具有干扰作用,其中代谢产物比母体化合物的作用更强。PBCHO能引起IL-12p70的分泌水平上升为阴性对照组的1.87倍,而PBCOH和PBCOOH则能诱导5.88和7.96倍的TNFα分泌水平。研究结果表明,在体外模型中,拟除虫菊酯类农药的共同代谢产物能引起比起母体化合物更强的免疫细胞毒性。(2)在初步评估拟除虫菊酯对单核细胞免疫毒性的基础上,选择联苯菊酯作为拟除虫菊酯类农药的代表,以人单核细胞U937和BALB/c小鼠分别作为体外和体内生物模型,通过多种体内外实验方法,研究拟除虫菊酯引起的免疫毒性及其对映体选择性,并利用分子生物学手段深入研究联苯菊酯对映体诱导免疫毒性的分子机制。体内实验结果显示,联苯菊酯并未引起任何免疫功能的紊乱,但能对脾脏细胞产生明显的氧化损伤和细胞毒性。在单核细胞体外模型中,联苯菊酯同样显示了免疫毒性作用,两个对映异构体在氧化损伤和细胞毒性的诱导上都显示出明显的对映体差异。通过引起不同程度的氧化损伤、干扰细胞内多条凋亡信号通路、产生选择性的细胞毒性,联苯菊酯对映异构体能引起立体选择性的免疫毒性。研究结果表明,联苯菊酯能对非靶标生物产生对映体选择性的免疫毒性。(3)拟除虫菊酯作为内分泌干扰物,可能会干扰生殖内分泌系统的激素信号传导网络,从而对哺乳动物和人类产生潜在的生殖危害。我们以人绒毛膜上皮癌细胞系JEG-3作为模拟胎盘作用的体外模型,研究联苯菊酯对细胞活性、激素分泌和相关基因表达的影响,探讨联苯菊酯外消旋体与其对映体对滋养层细胞激素功能的干扰作用及其分子机制,并通过分子模拟的方法预测不同对映异构体与雌激素受体α(ERα)的相互作用模式。在利用细胞活性实验确定暴露浓度的基础上,激素分泌和基因表达的实验结果表明,联苯菊酯不仅能够促进孕酮和人绒毛膜促性腺激素的分泌、诱导促性腺激素释放激素Ⅰ(GnRHI)及其受体GnRHRI表达水平的上调,还能显著改变类固醇生成基因的表达水平。联苯菊酯外消旋体和对映体都能通过雌激素受体通路的作用,干扰滋养层细胞中的激素信号通路,而且联苯菊酯对生殖内分泌相关激素的干扰作用显示出一致的对映体选择性顺序：S-BF>rac-BF>R-BF。分子模拟的结果显示,联苯菊酯对映异构体与ERα形成的复合物在柔韧性和构象变化上不存在明显的差异,但S-BF在与ERα的结合中表现出比R-BF更强的亲和力,这可能部分解释了联苯菊酯的对映体选择性生殖内分泌干扰作用。(4)低浓度拟除虫菊酯引起的潜在肝脏毒性及其分子机制仍不清楚,目前常用的肝脏疾病临床指标可能无法准确指示潜在肝脏损伤的发生。我们以BALB/c小鼠作为体内实验模型,通过对组织形态、酶活性、细胞活性、氧化损伤、caspase活性、细胞凋亡以及代谢相关基因表达水平的检测,全面评价联苯菊酯引起的潜在肝脏损伤,并深入研究毒性作用产生的分子机制。组织形态和血清酶活性都未发生明显变化。但联苯菊酯暴露对肝脏细胞产生细胞毒性和氧化应激,同时引起caspase激活和线粒体细胞凋亡通路的启动。基因芯片的结果显示,联苯菊酯能广泛地干扰代谢过程,强烈诱导CYPs、GPXs、GSTs和激酶等氧化应激相关基因。研究表明,即使在传统临床和病理指标没有出现明显肝脏损伤的情况下,联苯菊酯能够引起氧化损伤,通过caspase介导、线粒体相关的细胞凋亡,最终引起肝脏损伤。正在使用的手性农药的健康与生态安全已成为全球关注的新问题。我们的研究结果说明,拟除虫菊酯类农药可能通过引起对细胞的氧化损伤,干扰细胞内外各种信号传导网络,经由不同途径启动细胞凋亡,在分子与细胞水平上对不同的靶器官造成毒性作用。对映体选择性可能普遍存在于拟除虫菊酯引起的各种潜在毒性作用当中。在评价拟除虫菊酯类农药对于人类及哺乳动物的健康风险时,需要整合评价其对映异构体在分子、细胞、个体水平上的各种潜在毒性。