20世纪60年代，DNA双螺旋结构模型的提出使生命科学的研究进入了分子层面，并催生了核酸杂交技术。该技术发展迅猛，已被广泛应用于分子生物学、分子遗传学和生物医学等领域，而核酸探针的研发是影响其应用与发展的关键。其中，寡核苷酸探针由于具有序列较短、设计简单、人工合成效率高、响应速度快、选择性好等优点，备受广大科研工作者的关注。然而，常规一比一的信号响应模式在一定程度上限制了寡核苷酸探针的灵敏度。如何提高寡核苷酸探针的分析性能，仍是科研工作者亟待解决的问题。随着新型体外筛选技术——指数富集的配基系统进化技术（Systematicevolution of ligands by exponential enrichment, SELEX）的创立，多种功能寡核苷酸被筛选出来，突破了传统的基于核酸杂交技术建立的核酸研究与应用的范畴，极大地拓展了寡核苷酸探针在生物技术、医学诊断与治疗、细胞生物学、微生物学和化学等领域的应用。核酸适配体是其中一个典型的例子。核酸适配体是指通过SELEX技术筛选出来的能够与目标物特异性结合的寡核苷酸序列。该目标物可以是各种小分子、多肽、蛋白质，甚至是整个细胞、细菌或病毒。当与目标物特异性结合时，核酸适配体将折叠成特定的三级构型。通过利用核酸适配体构象的改变并结合适当的信号转换机制，多种核酸适配体传感器被研发。尽管如此，关于核酸适配体的研究和应用仍处于起步阶段。除了核酸适配体外，脱氧核酶也是通过SELEX技术筛选出来的功能寡核苷酸序列。脱氧核酶是指在特定的条件下（结合了特定的金属离子或者小分子），具有催化活性的寡核苷酸序列。基于脱氧核糖对金属离子的特异性识别，多种用于金属离子检测的脱氧核酶传感器被相继研发。尽管脱氧核酶相对传统的金属离子检测方法有着诸多优势，但将其应用于生物体系的报道至今仍比较少见。为了解决上述这些问题，我们在本研究论文中研发了多种新型功能寡核苷酸探针用于高灵敏度、高选择性、实时在线地检测不同体系中特定的疾病相关物。具体情况如下：第2章提出了由常规目标分子（非核酸序列）启动的循环链置换聚合扩增反应（cyclical common target molecule-displacement polymerization，简称CCDP）并将其成功应用于目标分子的信号放大检测。具体而言，我们通过将核酸适配体与发夹型DNA探针结合起来，设计了一种自封闭的双功能荧光寡核苷酸探针，用以平行检测两种不同的疾病相关物：PDGF蛋白和p53基因序列。基于CCDP的信号放大效应，本实验体系实现了对PDGF高灵敏度（检测下限为1.8×10-10M）和高选择性（浓度高出7~200倍的非特异性蛋白产生的荧光信号均可忽略）的检测。除此之外，本双功能探针还具有操作简便、响应速度快和响应范围宽等优点，有望为疾病相关物的研究提供一种强而有力的分析工具。第3章开发了一种整合了多重信号放大手段的电化学DNA传感器，用于癌症相关p53基因序列的超灵敏检测。具体而言，先通过金-硫键将捕获探针（CP）固定在金电极表面上。在起始状态下，CP呈发夹型结构，其茎干部含有一个EcoRI的限制性识别位点。经EcoRI酶处理后，CP上用于捕获目标DNA的序列以及标记了生物素基团的末端序列都被除去，从而防止了后续假阳性信号的产生。然而，当CP与目标DNA杂交后，CP的发夹结构被打开，由此破坏了EcoRI酶的识别位点，并迫使生物素基团从电极表面突出。通过生物素-链霉亲和素的结合反应将同时修饰了一个链霉亲和素和多个二茂铁信号探针的功能化纳米金颗粒捕获到电极表面。基于纳米金颗粒的富集效应，目标DNA所引起的电化学响应信号得到显著增强。此外，通过信号探针与经EcoRI酶处理后残余在电极表面上的CP片段之间的杂交，将二茂铁标签拉近电极表面，从而提高了界面电子的转移效率，进一步完善了电化学响应信号。通过这些元素的有效整合，本实验体系实现了对目标DNA超灵敏（zeptomole水平）和宽动力学响应范围（跨7个数量级）的检测。第4章开发了一种电化学SNP传感器，用于癌症相关基因序列的诊断分析。为了提高检测的灵敏度，我们通过结合纳米金颗粒的富集效应和基于DNA杂交的拉近策略实现了对目标DNA高灵敏度（检测下限为4fM，相当于在10μL的样品中存在40zmol的目标分子）和宽动力学响应范围（10fM-1nM）的检测。与此同时，通过引入等位基因特异性的核酸连接酶反应，本体系能够很好地区分单碱基错配序列。此外，本实验体系对从患者样本和标准细胞系中提取的基因组的PCR扩增产物均表现出较好的分析能力，从而证明了本电化学SNP传感器在基础研究和临床应用等领域均有着很大的潜力。第5章利用二酰基脂质-DNA共轭物在细胞表面上构建了特定的脱氧核酶用于检测细胞外微环境中的目标金属离子。实验结果表明固定在细胞膜上的脱氧核酶对外加的及细胞自身分泌的目标金属离子均表现出优异的响应性能。本传感体系还可以通过在细胞膜上修饰不同的功能寡核苷酸探针来实现对多种目标物的实时在线监测。由于制备简单和性能优异，基于二酰基脂质-DNA共轭物的细胞表面传感器在细胞生物学、生物医学、组织工程和新药物研发等领域中均有着很好的应用潜力。第6章开发了一种细胞靶向、自输送、光可控的分子信标（MB），用于实时监测指定细胞内的目标mRNA。在具体的实验方案中，我们设计了一种双链结构的DNA探针，其中的一条DNA链是由可细胞内在化的核酸适配体AS1411加上一段与MB互补的延伸序列组成，用作往靶细胞内输送MB的载体探针（CP）；另一条是MB，用于检测细胞内的目标mRNA。为了实现对MB检测性能的光调控，我们在CP的捕获序列中嵌入了两个光敏切割基团。当CP/MB检测探针通过AS1411的介导作用被运输到细胞质中并经特定的光照射后，MB从CP上释放下来，从而恢复其对目标mRNA的响应能力。