磁共振成像无组织器官深度局限性,无电离辐射,能获得高空间分辨率的活体三维图像,因而具有独特的优势,MRI是临床及临床前研究的领先诊断技术,能在不同时间点无创、重复地评估相同活体的生物学过程,从而明显降低所需动物的数量及成本。然而,由于缺乏具有高弛豫率、低毒或无毒的、体内循环时间最优的理想对比剂,磁共振在诊断具有特定的分子标志物的病变方面以及监测药物治疗效应方面的应用受到了极大的限制。目前临床常用的MRI对比剂Gd-DPTA的弛豫率偏低,应用于动物及病人身上的注射剂量高达0.1mmol每公斤体重。另外Gd-DPTA不适用某些需要进一步延长检查时间的体内磁共振成像,因为小的螯合分子具有很高的肾小球滤过率。故随着磁共振成像应用范围的不断扩展,临床对特异性的有效对比剂的需求越来越迫切,特效对比剂的重要性也越来越大,近年来,分子影像学及细胞分子标记领域有了巨大的发展和进步。靶向传递能增加对比增强的有效性、减少剂量和毒性,是一种能满足影像诊断学需求的良好策略,因此十分有必要研发靶向特异性的磁共振对比剂用于疾病的鉴别诊断。受体介导的靶向传递在增强影像对比的同时还能增加治疗药物的有效性,多模态成像比传统的单模态成像具有更多独特的优势。以前已有研究证明氧化钆(Gd2O3)纳米颗粒具有比目前广泛使用的钆螯合剂更高的弛豫效能。因此,基于Gd2O3的纳米颗粒可以用作高效的T1对比剂,提供阳性增强信号,这吸引了广泛的研究兴趣。但是它们存在稳定性和释放游离钆离子的问题,未结合的钆离子因抑制钙通道而具有相当大的心血管及神经毒性。而基于无机晶体钆的复合物纳米颗粒可以提供一个严格的晶体环境,这样能有效地阻止纳米颗粒释放游离钆,因而被认为是新一代的T1对比剂。原则上,氧化钆纳米颗粒在提供增强对比的同时还能提供更多的与修饰物分子直接连接的可能。在本研究中,我们尝试合成肿瘤分子标志物叶酸受体靶向的、带荧光标记的顺磁性双模态纳米颗粒Gd2O3-FI-PEG-FA,该纳米颗粒能同时发挥顺磁性及荧光对比剂的作用,可实现磁共振和光学双模态成像的对比增强,为肿瘤及其转移灶的早期诊断、术后复发与术后纤维瘢痕的鉴别诊断及实时监测药物疗效与体内分布情况等探索新的途径。本课题还对所制备的Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒的理化特性、细胞毒性及其在体外主动靶向Hela细胞进行荧光显像及MR成像的效果等进行了初步评价。第一章新型叶酸靶向MR对比剂Gd203-FI-PEG-FA纳米微粒的制备及其理化特性的初步研究研究目的制备新型叶酸受体介导的主动靶向性MR对比剂——叶酸及荧光素双标记的PEG化的Gd2O3(Gd203-FI-PEG-FA)纳米微粒,并对其理化性质进行测定和初步评价,以判断其临床应用的可能性与前景。第一节新型叶酸靶向MR对比剂Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒的初步制备材料及方法1Gd2O3纳米微粒的制备：取Gd(OAC)。(670mg,2mmo1)溶解在30mLDMSO中,搅拌均匀后缓慢滴加四甲基氢氧化铵(TMAH,1g,5.6mmol)和10mL无水乙醇混合物。溶液室温下搅拌2h后离心分离,固体用乙醇洗涤三次得到Gd2O3。2荧光素表面修饰Gd2O3的制备：取Gd2O3(200mg)分散在DMSO中,加入5(6)-羧基荧光素(100mg),室温下搅拌12h后离心分离,固体分别用DMSO,乙醇和二氯甲烷洗涤三次得到荧光素表面修饰Gd2O3(Gd2O3-FI)。3PEG和荧光素表面修饰Gd2O3的制备：取荧光素表面修饰Gd2O3(100mg)分散在DMSO中,加入a-羧基,w-羟基聚乙二醇(分子量2000)(100mg),室温下搅拌12h后离心分离,固体分别用DMSO,乙醇和二氯甲烷洗涤三次得到PEG和荧光素表面修饰Gd2O3(Gd203-FI-PEG)。4携叶酸、PEG和荧光素表面修饰Gd2O3的制备：取PEG和荧光素表面修饰Gd203(Gd2O3-FI-PEG)(100mg)分散在DMSO中,加入叶酸(2Omg), EDC.HC1(20mg)和NHS(20mg),室温下搅拌12h后离心分离,固体分别用DMSO,乙醇和二氯甲烷洗涤三次得到携叶酸、PEG和荧光素表面修饰Gd203(Gd203-FI-PEG-FA)o第二节新型叶酸靶向MR对比剂Gd203-FI-PEG-FA纳米微粒的理化性质测定材料及方法1Gd2O3-FI-PEG纳米微粒、Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒透射电子显微镜下形态观察：取少量Gd2O3-FI-PEG纳米微粒、Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒悬浊液用去离子水稀释后,滴少许于敷有支撑膜的铜网上,静置约5分钟后,用滤纸小片从铜网边缘吸干多余液体,红外灯下静置干燥后,置透射电子显微镜下观察纳米微粒子的大小和形态。2Gd2O3-FI-PEG纳米微粒、Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒粒径及分布的测定：用Malvem Zetasizer3000HS激光散射粒度分析和电位测定仪测定两种纳米微粒的粒径及分布：两种样品各取5ul,用蒸馏水稀释至测量杯中,放入样品槽中测试。所选激光光源的波长为633.0nm,测试温度为25.00±0.05。C。3Gd2O3纳米微粒、Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒的傅里叶变换红外光谱分析：将Gd2O3纳米微粒、Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒悬液滴在硒化锌窗片上,吹干用FT-IR仪扫描,扫描范围为4000cm-1-400cm-1.4Gd2O3-FI-PEG纳米微粒、Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒的热重力分析：热分析使用Netzsch STA449C Jupiter仪,同时使用质谱仪(Netzsch:QMS403C Aeolos)通过一个热传递毛细管进行原位气体分析,温度在氦气流速率为80mL/min的条件下,以10。C/min的速率升至800。C,200。C持续约40min。5Gd203-FI-PEG纳米微粒、Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒的X射线衍射(XRD)分析：取风干的Gd2O3-FI-PEG纳米微粒及Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒粉末,置于Philips X-射线粉末(多晶)衍射仪中,采用镍过滤的CuKa放射线(λ=1.5418A,40kV,40mA),扫描范围是20,步长为0.025。,每步时间是4s。6Gd2O3-FI-PEG纳米微粒、GdA-FI-PEG-FA纳米微粒T1值的测定及T1弛豫率的计算：将Gd2O3-FI-PEG纳米微粒、Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒悬浊液稀释,并按钆浓度为1.5、0.75、0.38、0.19、0.1、0mmol/L分别装于6只EP管中,置于塑料试管架上,在MR机器上进行横断面扫描,采用8通道头部线圈,扫描序列采用Tlmap,随后测量各个浓度试管中部4个层面的T1值,取其平均值,计算样品的T1弛豫率,即含钆浓度与1/T1直线方程的斜率。结果1透射电子显微镜下Gd2O3-FI-PEG纳米微粒、Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒的形态大小：Gd2O3-FI-PEG纳米微粒、Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒均呈类圆形、大小均匀的黑色颗粒,较分散,仅有少许团聚现象,电镜下估算其平均粒径约25～30nm。2Gd2O3-FI-PEG纳米微粒、Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒的Malvern-300CHS激光粒度分析仪测定结果：Gd203-FI-PEG纳米微粒：强均粒径di=126nm,峰面积：100%,峰数为1；体均粒径dr=70.7nm,峰面积：100%,峰数为1：数均粒径dn=45.5nm,峰面积：100%,峰数为1；多分散系数为0.26。Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒：强均粒径di=132.5nm,峰面积：100%,峰数为1;体均粒径dr=61.4nm,峰面积：100%,峰数为1；数均粒径dn=37.6nm,峰面积：100%,峰数为l；多分散系数为0.28。3Gd2O3纳米微粒、Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒傅里叶转换红外光谱分析结果：Gd2O3最显著的峰出现在1400-1600cm-1波数范围内,主要是由反对称的及对称的COO-产生,属于羧酸盐伸缩模式。Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒的吸收频率特征包括：在3420cm-1附近、1100cm-1附近出现强而宽的经基键(-OH)和伸缩振动的C-OH吸收峰,在2925cm-’处出现弱的烷基键(C-H)吸收峰,在1659cm-1处出现羰基(C=0)吸收峰,在1537cm-1处出现弯曲振动和伸缩振动的N-H、C-N键吸收峰,这些光谱改变表明叶酸及PEG分子已经连接到Gd2O3纳米颗粒表面,另外在Gd2O3的红外光谱上能看到明显的羧酸盐伸缩模式,而在Gd2O3-FI-PEG-FA的光谱上却消失了,这与Gd2O3纳米颗粒表面包被了PEG及叶酸是一致的。4Gd2O3-FI-PEG纳米微粒、Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒的热重力分析结果：当加热到800。C时,Gd2O3-FI-PEG-FA纳米颗粒总失重70%,Gd2O3-FI-PEG总失重55%。主要的质量损失发生在200。C以上。5Gd2O3-FI-PEG纳米微粒、Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒的X线衍射分析结果：Gd2O3-FI-PEG纳米微粒、Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒的主要成份为面心立方尖晶石结构的Gd2O3,且Gd2O3粒子的结晶状态良好,表面修饰对Gd2O3的晶型没有影响。6Gd2OO3FI-PEG纳米微粒、Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒T1值测定及T1弛豫率的计算结果：Gd2O3-FI-PEG纳米微粒、Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒悬浊液浓度(mmol/L)与1/T1的回归方程分别为：Y=3.964X+0.201, R2=0.998; Y=6.540X+0.183, R2=0.999.样本的T1值随着钆浓度的增加逐渐下降,Gd2O3-FI-PEG纳米微粒、Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒的T1弛豫率分别为3.964mM-1s-1、6.540mM-1s-1,均高于Gd-DTPA (3.5mM-1s-1)结论1.本章成功合成了一种新型氧化钆纳米微粒—-Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒,粒径约25-30nm,大小较均匀,多分散性好,具有强大T1弛豫效应,能够满足Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒作为长循环肿瘤靶向对比剂的基本要求。2.本课题合成的Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒的有机成分含量高,为叶酸受体介导的肿瘤靶向性MR成像及实时荧光显像提供了物质基础。第二章新型叶酸靶向MR对比剂Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒的体外细胞实验研究目的：初步评价新型叶酸靶向MR对比剂Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒的细胞毒性和体外主动靶向肿瘤细胞的能力。第一节新型叶酸靶向MR对比剂Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒的细胞毒性实验(MTT法)材料及方法1人宫颈癌细胞Hela、乳腺癌细胞MDA-MB-231、正常心肌细胞H9C2的复苏与培养：从液氮罐中取出含细胞Hela、乳腺癌细胞MDA-MB-231、正常心肌细胞H9C2的冻存管,直接投入37℃恒温水浴箱,待融化后,离心3min,800r/min,除去上清液后,分别用含10%PBS的RPMI-1640培养液、高糖的DMEM培养液(用于后两种细胞)5ml重新悬浮细胞后接种培养瓶,置入5%C02、37℃培养箱中静置培养。当细胞达80%的融合度时,胰酶消化2min左右,用吸管轻轻吹打细胞,直至贴壁细胞悬浮。2MTT法检测药物的细胞毒性：将Hela细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞、正常心肌H9C2细胞悬液接种于96孔板中(5×103个、5×103个、1×104个/孔),培养24h/48h后分别加入Gd203-FI-PEG悬浊液,浓度分别为每孔含钆1.103、0.828、0.414、0.207、0.103、0.052(mM),每组设6个复孔。仅含培养基者作为调零孔,分别以仅含Hela细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞、正常心肌H9C2细胞者为正常对照孔。培养24h/48h后,加入浓度为5mg/ml的MTT的D-hanks溶液,继续孵化4h,加入150ulDMSO,平板震荡仪震10min,在酶标仪中测定490nm波长处的吸光度值(OD值),并计算细胞存活率,即(样品孔的OD值一样品对照孔的OD值)/正常对照孔的OD值。MTT法检测GdA-FI-PEG对于正常心肌H9C2细胞的120h存活率(接种细胞1000个/孔)、Gd2O3-FI-PE-FA对于Hela细胞的24h/48h(接种细胞5×103个/孔)及120h(接种细胞700个/孔)存活率,方法同上。3统计学分析：采用SPSS13.0软件包对结果进行描述性统计分析,及单向方差分析,存活率>80%认为药物对细胞生长无明显抑制效应,以药物浓度为单一因素分析,P<0.05则认为浓度对细胞毒性影响的差异有显著性意义。结果随着培养液中钆浓度的增加,Gd20-FI-PEG纳米颗粒引起Hela细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞、正常心肌H9C2细胞24及48h生存率的下降趋势不明显,高浓度时(1.103mM/孔)各细胞生存率均大于80%；随着培养液中钆浓度的增加,Gd203-FI-PEG纳米颗粒对正常心肌H9C2细胞长期(120h)存活率亦无明显抑制作用,高浓度时(1.103mM/孔)H9C2细胞存活率大于80%；随着培养液中钆浓度的增加,Gd203-FI-PE-FA引起Hela细胞的24h/48h存活率下降趋势亦不明显,高浓度时(1.103mM/孔)细胞生存率大于80%；但是随着培养液中含钆浓度的增加,Gd203-FI-PE-FA对Hela细胞120h存活率的抑制作用呈梯度升高,各浓度组间细胞存活率差异有统计学意义(P<0.05),当Gd浓度高于0.2mM时,Hela细胞的长期(120h)存活率降至80%以下。第二节Hela细胞摄取Gd2O3-FI-PEG-FA及Gd2O3-FI-PEG纳米颗粒的荧光显像材料及方法将冻存的人宫颈癌Hela细胞复苏后接种于培养瓶中,加含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液适量,37。C,5%CO2条件下培养,待细胞达到80-90%汇合后,胰酶消化,接种于6孔细胞培养板上(每孔细胞数为5×105个),孵化24h后,用PBS液洗涤三遍,加入含0.828mM的Gd2O3-FI-PEG或Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒悬浊液的1640完全培养液2ml孵化4h后,再用PBS液洗涤三遍,以未加入氧化钆纳米颗粒溶液的细胞作为空白对照,每孔分别加入4%的多聚甲醛溶液lml,固定15min后,用PBS液洗三遍,加入DAPI染液200ul,室温下染3-5min后用PBS液洗三遍,于倒置显微镜下观察,拍照比较Hela细胞与含上述两种纳米微粒的培养基孵化4h后、经DAPI染色后颜色的差异。结果未加入含钆溶液的空白对照组与Hela细胞孵育4h后,DAPI染核后,细胞胞质内未见任何绿色荧光,核为蓝色；与空白对照组相比,Gd2O3-FI-PEG-FA组与Hela细胞孵育4h,DAPI染核后,Hela细胞核被染成亮蓝色,胞质充满绿色荧光；而Gd2O3-FI-PEG组与Hela细胞孵育4h,DAPI染核后,Hela细胞只有核被染成亮蓝色,胞质内无绿色荧光或仅有本底的绿色荧光。第三节Hela细胞摄取Gd2O3-FI-PEG-FA纳米颗粒的磁共振成像材料及方法1收集Gd2O3-FI-PEG-FA纳米颗粒标记的Hela细胞Hela细胞均匀接种于4个直径为l0cm的培养皿中,待细胞达到60%的融合时分别加入含Gd浓度为0.828,0.55,0.18,0(MM)的完全培养基,37。C,5%C02条件下孵育4h后用PBS冲洗3遍,胰酶消化3-5min,收集细胞沉淀,再用PBS洗3遍,每皿细胞计数约4.5×106个,细胞沉淀重悬于100u11%的琼脂糖溶液中,以100ul的无细胞1%的琼脂糖溶液做参照,进一步行T1加权MR成像。2MR扫描方案Philips Achieva3. OT磁共振,8通道头部线圈,TSE序列的TIWI。扫描参数：翻转角90。,TR-500ms, TE-10ms,层厚4mm,层间距0.5mm, FOV130mm,NSA为2。3统计学分析采用SPSS13.0统计软件,不同Gd浓度组与空白对照组及1%琼脂糖之间的信号强度比较应用单向方差分析,两两比较采用SNK法,P<0.05认为差异有统计学意义。结果不同Gd浓度组信号强度均明显高于空白对照组及琼脂糖参照组,差异有统计学意义(P<0.05),细胞信号强度随培养液Gd浓度增高呈升高趋势,不同Gd浓度组之间信号强度差异有统计学意义(P<0.05),空白对照组、琼脂糖参照组均与EP管周围水的信号强度相当,两者信号强度差异无统计学意义(P>0.05)。结论1本实验合成的Gd2O3-FI-PEG-FA及Gd2O3-FI-PEG纳米颗粒因无明显的短期细胞毒性而具有良好的生物相容性；较高浓度的Gd2O3-FI-PEG-FA所表现出的对靶细胞的长期细胞毒性有待进一步检测；2GdA-FI-PEG-FA成功实现了荧光及靶向配体双修饰,体外荧光成像表明靶细胞对Gd2O3-FI-PEG-FA具有高摄取率；3体外细胞磁共振扫描证实磁共振可有效地检测目标肿瘤细胞摄取Gd2O3-FI-PEG-FA(即便是较低浓度)后的信号改变,说明本实验合成的Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒可初步实现主动靶向肿瘤细胞的MR成像,且具有提高磁共振成像敏感性的潜能。第三章新型叶酸靶向MR对比剂Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒的健康裸鼠体内分布实验及急性毒理实验研究目的：初步探讨Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒在健康裸鼠体内的分布及排泄情况；研究G.d2O3-FI-PEG-FA对健康裸鼠的急性毒副作用,进一步评价其临床应用可行性第一节Gd2O3-FI-PEG-FA及Gd2O3-FI-PEG纳米微粒在健康裸鼠体内分布及排泄的初步研究材料及方法将6只4到6周龄的健康雌性裸鼠分为2组：Gd2O3-FI-PEG-FA组(n=3)、G-d2O3-FI-PEG组(n=3)；腹腔注射0.3—0.4ml的0.3%戊巴比妥钠麻醉动物,经尾静脉分别缓慢注射0.5ml Gd2O3-FI-PEG-FA及Gd2O3-FI-PEG悬浊液(Gd浓度3mM)。每只裸鼠注药前拍本底荧光及白光照片,注药后每隔5min-30min拍一次荧光及白光照片,保证相同的曝光时间,初步考察Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒及Gd2O3-FI-PEG纳米微粒在健康裸鼠体内各主要器官的分布情况。后处理：将对应时间点的白光及荧光照片融合。结果1Gd2O3-FI-PEG-FA组与Gd2O3-FI-PEG组纳米微粒在动物体内各器官的分布情况大致相同,两种纳米颗粒主要通过消化道及肾脏排泄：叶酸连接对Gd2O3-FI-PEG-FA纳米颗粒在健康裸鼠体内的分布及排泄无明显影响；2Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒在健康裸鼠体内循环时间长达3小时或以上,是潜在的长循环对比剂；注药48h后动物体内基本无药物残留。第二节Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒的急性毒理实验材料和方法1空白对照组(n=3)：每只健康裸鼠经腹腔注射0.3%戊巴比妥钠0.3-0.4ml麻醉后,尾静脉注射0.5ml生理盐水；实验组：继续沿用第三章第一节的Gd2O3-FI-PEG-FA组裸鼠(n=3)。两组裸鼠均为雌性,周龄、体重相当。2经干预后每天观察两组裸鼠的健康状况：皮肤、活动状态、体重变化等；周后行颈椎脱臼法处死动物,快速取出其脑、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏以及心脏组织,经固定、包埋、蜡封、脱蜡后行HE染色观察各组织器官的细胞形态变化。结果1一般观察：两组裸鼠经干预后健康状况均良好,表现为皮肤红润,活动自如,摄食无明显减少,体重逐渐增加。2HE染色观察：实验组及空白对照组裸鼠各器官均无损害,各器官的细胞形态正常,无明显变性、坏死。结论1本实验制备的具有荧光素标记的两种Gd2O3纳米微粒,能实时、无创地监测药物在动物体内分布和排泄过程；2Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒在健康裸鼠体内循环时间长达3小时或以上,是潜在的长循环对比剂,有望通过延长相应的检查时间来增强对比剂的肿瘤靶向作用；注药48h后动物体内基本无药物残留,又说明药物在体内蓄积而产生毒性的可能性小；因此Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒具有较优的体内循环时间；3注射高浓度Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒对健康裸鼠无明显急性毒副作用,进一步说明Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒的生物安全性高,是有望用于临床的MR对比剂。本研究的不足及有待改进之处①要使Gd2O3纳米颗粒获得更高的T1弛豫率,需进一步优化合成方法,合成粒径更小的纳米颗粒；②对Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒潜在的释放游离Gd3+的测定缺乏定量分析；③需进一步的动物实验检测Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒在体内靶向肿瘤的效果；④需进一步的实验研究Gd2O3-FI-PEG-FA纳米微粒的准确半衰期及各器官分布的详细情况。