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胃癌在全球肿瘤导致人类死亡原因中居第二位,据估计每年有超过七十万的患者死于该疾病。在前期工作中,我们发现磷脂酶A2(PLA2)与胃癌细胞的增殖相关,cPLA2是PLA2的主要活性组成,其中磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)(cPLA2-a, cPLA2-IVA)是胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)中含量最多的亚型,是一类钙离子依赖型、相对分子质量为85000D的蛋白。它有2个催化区域和一个N末端调控C2区域,该区域参与磷脂与钙依赖脂质结合(CaIB)模体结合。cPLA2是细胞内迅速产生20多种脂质介质的磷脂酶A2的主要亚型,通过特异性水解磷脂二位酰基(Sn-2)位点的脂酰键,产生花生四烯酸(Arachdonic Acid, AA)和溶血卵磷脂,AA继而在多种酶的作用下产生多种代谢物质：在环氧化酶(cyclooxygenase, COX)的催化作用下产生前列腺素(Prostaglandin E2, PGE2),在脂肪氧合酶(Lipoxygenases, LOX)的催化作用下产生白三烯(Leukotrienes, LTs),在细胞色素P450催化作用下产生羟基廿碳四烯酸(Hydroxyeicosatetraenoic Acid, HETE)。这些物质广泛参与人体生理性细胞内外的信号传导及炎症、多种免疫相关性疾病等多种病理反应,它们在肿瘤发生发展中的可能作用已开始引起了人们的广泛兴趣。因此,我们推测磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)作为一个炎症前因子可能对胃癌的生物学功能起着重要的调控作用。环氧化酶2(COX-2)-PGE2轴是结肠癌研究中被广泛用到的通路,二者在结肠癌中均高表达,临床研究表明非甾体类抗炎药是环氧化酶1(COX-1),环氧化酶2(COX-2)的抑制剂,长期服用可以降低40%结直肠癌的发生,而且环氧化酶2(COX-2)的抑制剂能减低FAP向肠癌的转变。目前已经有文献报道肺癌中磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)呈过表达状态,肠癌中表达不明确；胃癌中磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)研究甚少,但是环氧化酶2(COX-2)在胃癌中的研究非常多,且它在胃癌发生发展过程中起到非常重要的作用,因此,我们推测环氧化酶2(COX-2)是否通过磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)来发生作用。二者表达是否相关,二者对胃癌的预后又有何关系?因此本文从三部分进行研究：第一部分应用小RNA干扰技术下调磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)表达,利用CCK-8检测磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)低表达后对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响,流式细胞仪检测磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)低表达后对胃癌细胞SGC-7901周期、凋亡的影响；划痕实验检测磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)低表达后对胃癌细胞SGC-7901迁移的影响。第二部分观察cPLA2-α小分子抑制齐Pyrrophenone对胃癌细胞SGC-7901增殖、周期、凋亡和迁移的影响,检测方法与第一部分相同。第三部分首先在60例新鲜胃癌组织和癌旁正常组织中从转录水平检测磷脂酶A2-IVA和环氧化酶2(COX-2)的表达,利用免疫组织化学的方法在大样本(866例)胃癌组织芯片中检测磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)在胃癌组织和癌旁组织中的表达情况,分析磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)与胃癌病理参数的相关性,最后利用单因素和多因素的统计学方法来预测磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)对胃癌预后的指示作用。预期该实验可以为胃癌的治疗研究提供新的候选靶点和药物。流程图如下(图1)：第一部分干扰磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)对胃癌细胞生物学功能的影响目的：应用小RNA干扰技术下调磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)表达,利用CCK-8检测磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)低表达后对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响,流式细胞仪检测磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)低表达后对胃癌细胞SGC-7901周期、凋亡的影响；划痕实验检测磷脂酶A2-IVA(PLA2G4A)低表达后对胃癌细胞SGC-7901迁移的影响。方法：10株细胞系,从蛋白质和RNA水平检测磷脂酶A2-IVA(PLA2G4A)表达；筛选磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)高表达的胃癌细胞系构建针对磷脂酶A2-IVA(PLA2G4A)的小RNA干扰片段利用Lipo2000进行细胞转染;转染后检测胃癌细胞增殖、迁移、周期、凋亡变化。结果：SGC7901、MKN45高表达磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A),SNU1,SNU5为悬浮细胞,其余细胞均为低表达或不表达磷脂酶A2-IVA(PLA2G4A),故后续实验选用SGC7901或者MKN45。成功构建cPLA2-siRNA；当cPLA2-α被干扰之后,细胞的增殖没有发生变化。随着时间的延长,干扰组的划痕生长速度慢于NC组。干扰组细胞S期延长,即发生S期阻滞。干扰组凋亡稍多于NC组,但二者无统计学意义。结论：磷脂酶A2-IVA(PLA2G4A)调控胃癌细胞的周期进程,促进胃癌细胞的迁移。第二部分磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)小分子抑制剂对胃癌细胞生物学功能的影响目的：观察cPLA2-α抑制剂Pyrrophenone对胃癌细胞SGC-7901增殖、周期、凋亡和迁移的影响。方法：常规细胞培养,利用CCK-8检测磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)小分子抑制剂Pyrrophenone对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响,流式细胞仪检测磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)小分子抑制剂Pyrrophenone对胃癌细胞SGC-7901周期、凋亡的影响；划痕实验检测磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)小分子抑制剂Pyrrophenone对胃癌细胞SGC-7901迁移的影响。结果：Pyrrophenone分别为不同浓度下时检测6个时间点其对胃癌细胞增殖情况的影响。随着时间的延长,Pyrrophenone对SGC-7901细胞的增殖抑制率逐渐增加；在同一浓度下时随着Pyrrophenone浓度的升高,其对SGC-7901细胞的增殖抑制率也呈逐渐上升趋势。通过计算得出,48小时Pyrrophenone对SGC-7901细胞的半数抑制率(IC50)为9.4nmol。细胞周期检测结果表明：加药后细胞S期明显延长,细胞生长阻滞。加药组的划痕生长速度明显降低,从而得出结论：磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)的小分子抑制剂Pyrrophenone可以抑制胃癌细胞SGC7901的迁移。凋亡实验两组未见明显凋亡.结论：Pyrrophenone抑制胃癌细胞SGC-7901的周期进展,细胞发生S期阻滞,并可以抑制胃癌细胞SGC7901的迁移,cPLA2-α有望成为肿瘤治疗的新靶点。第三部分磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)在人胃癌组织中的表达与临床病理参数及预后的相关性分析目的：研究磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)及环氧化酶2(COX-2)在人胃癌组织中的表达,以及与胃癌患者临床病理参数相关性分析,生存曲线分析二者对胃癌患者预后的影响。方法：60例新鲜胃癌组织及癌旁组织,提取总RNA,进行RT-PCR反应,从mRNA水平检测磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)和环氧化酶2(COX-2)的表达人胃癌组织芯片(共866例胃癌患者),利用免疫组织化学的方法检测磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)和环氧化酶2(COX-2)的表达,分别比较胃癌和癌旁组织中的阳性表达率。分析磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)、环氧化酶2(COX-2)与胃癌患者临床病理参数的相关性；COX模型分析二者对胃癌患者预后的影响。结果：磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A) mRNA在胃癌和癌旁组织中表达无统计学差异；环氧化酶2(COX-2) mRNA在胃癌中明显高表达,有统计学差异(P<0.001)。组织芯片结果显示：磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)在癌旁组织高表达,表达阳性率为84%(694/826)；在癌组织中表达阳性率较低为49.3%(417/845),且随着胃癌恶性程度的增加,阳性率逐渐下降。环氧化酶2(COX-2)在癌组织高表达,阳性率为54.0%(448/830),在癌旁组织中表达低,为25.9%(212/819)。磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)表达与患者性别、年龄和肿瘤部位无关,但是与胃癌肿瘤大小、肿瘤分化程度、Lauren分型、TNM分期相关。在肿瘤体积小、高分化、肠型、TNM1期的胃癌组织中磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)表达较高。环氧化酶2(COX-2)表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、TNM分期无关,但是与肿瘤分化程度、Lauren分型相关。Kaplan-Meier生存曲线：从生存曲线图中得出：单独磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)阳性患者生存率高于单独磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)阴性患者生存率；环氧化酶2(COX-2)趋势相反,与之前报道结论一致。而磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)阳性同时环氧化酶2(COX-2)阴性的胃癌患者总的生存率是最高的,反之,胃癌患者生存率最低。二者表达趋势一致时生存率处于中间状态。结论：磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)表达与患者性别、年龄和肿瘤部位无关,但是与胃癌肿瘤大小、肿瘤分化程度、Lauren分型、TNM分期相关。在肿瘤体积小、高分化、肠型、早期胃癌中,磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)表达较高。磷脂酶A2-IVA (PLA2G4A)阳性同时环氧化酶2(COX-2)阴性的胃癌患者总的生存率是最高的,反之,胃癌患者生存率最低。二者联合可以作为预测胃癌患者良好预后的更佳指标。