目前对于诸如急、慢性肝衰，进行性免疫性肝病，晚期肝硬化，多种遗传性肝病等一些终末期肝病的治疗，我们仍主要进行肝脏移植治疗，发展了将供肝分切成块以及辅助肝移植等多种移植方式，这些方法都最大限度的利用了供肝。然而，这些有限的办法，无法从根本上解决供肝极度缺乏的现状。随着肝细胞移植治疗的兴起，细胞移植有望成为缓解肝源缺乏或成为肝移植的替代疗法。以干细胞诱导分化为肝脏细胞的技术日趋成型，各种干细胞特别是胚胎干细胞(ESC)都有报道由其诱导出的细胞表达出肝脏细胞的特性，这必将给终末期肝病细胞移植治疗提供异常丰富的肝脏细胞来源。 胚胎干细胞(ESC)是从哺乳动物5～7天早期胚胎囊胚腔内侧的内细胞团或桑椹胚分离出来的、能在体外长期培养的、高度未分化的全能(totipotent)细胞系。具有发育全能性，自我复制和更新并保持亲代特征的无限分化潜能及可塑性极强的细胞。理论上可以分化成机体任一组织细胞，利用ES细胞在体外扩增可以定向诱导转化成肝脏细胞。1998年Thomson和J．Gearhart分别成功地分离并建立具有多向分化潜能和永久生殖能力的ES细胞系和胚胎瘤干细胞系(EC细胞系)，2001年Hamzaki首先在体外采用细胞因子阶段诱导法成功诱导分化出肝细胞，此后各中心关于体外诱导肝细胞的研究蓬勃发展，迄今为止，已明确胚胎干细胞在一定条件下体外诱导可定向转化为肝脏细胞。但是，关于胚胎干细胞源性的肝脏细胞体内移植研究还远不及其体外研究成熟。在仅有的几篇报道中已明确未分化ES细胞直接移植到肝损伤小鼠肝内会形成畸胎瘤，而关于移植细胞数量和移植何种分化程度的细胞为最佳选择均观点不一，厄需进一步深入探索。此外，移植细胞的定位示踪是体内移植研究的一个关键问题，目前相关文献报道的体内移植细胞示踪剂多为荧光物质(如GFP报告基因)，或通过原位性别杂交技术示踪移植细胞。上述方法存在的问题是了解移植细胞体内定居、增殖情况时，均需取得肝脏做组织切片检查，这就失去了动态观察移植细胞在宿主体内连续性变化的机会，且不适用于未来临床实验研究。所以，寻找一种无创伤性、并可以动态连续示踪移植细胞在受体内分布情况的检测手段非常必要，近年新兴的以超顺磁性氧化铁颗粒标记干细胞，是一种利用磁共振成像(MR1)技术达到非侵入性地追踪标记后移植细胞的新技术。以此通过MRI技术对干细胞进行可视化和追踪。在此研究背景下，本课题将主要以胚胎干细胞的非定向诱导，即自发分化为基础，用超顺磁性氧化铁标记体外自发分化后的不同时段的胚胎干细胞，通过不同体内途径移植到肝损伤模型中，运用活体示踪及免疫荧光示踪，对移植细胞的体内定居、增殖和功能活动情况进行探讨，了解移植细胞对肝损伤肝脏的修复以及受损肝脏组织的重建情况。从而为ES源性的肝细胞最终临床应用于治疗终末期肝病提供理论支持。 第一章:体外诱导ES细胞自发分化和标记移植细胞的相关生物学特性检测 目的：探讨胚胎干细胞在无定向诱导措施下体外自发分化的细胞情况；菲立磁及CFDA—SE标记待移植细胞的效率和活性；体外MRI下引发信号改变的最低超顺磁性氧化铁(菲立磁)标记细胞浓度，分析最适移植细胞的菲立磁标记浓度。 方法：用培养拟胚体和体内成瘤分化试验鉴定E14小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)的分化性能；常规培养增殖ES细胞，用悬浮培养法培养4d形成拟胚体(embryonic bodies，EBs)，然后转移EBs至6孔板自发分化，运用免疫荧光化学分析测定自发分化细胞第6d、9d、12d、18d，AFP和ALB的表达，检测自发分化细胞的肝细胞样功能特性；分别以超顺磁性氧化铁颗粒(菲立磁)和CFDA—SE标记ES和自发分化细胞，了解标记效率及活性；以50μg/ml及100μg/ml的菲立磁浓度标记移植细胞，并体外检测数量级为1×104、5×104、1×105、5×105、1x106的标记细胞在MRI下引发信号改变情况。 结果：由ES分化性能良好的细胞悬浮培养，拟胚体呈现出圆润饱满的形态；通过将ES移植在免疫缺陷小鼠皮下，1周即可长出畸胎瘤，3周后畸胎瘤明显；自发分化的EBs分化出各具三种胚层细胞形态的细胞，并能形成类似肝脏细胞形态的双核或多核多角形上皮样细胞；运用免疫荧光化学检测自发分化的肝脏样细胞，显示最早在第9d可在分化细胞团的外围细胞检测出AFP的表达，在第18d相似位置可检测出ALB的表达；同时相比100ng/ml以50μg/ml的菲立磁浓度标记细胞效率及活性最高；体外最适移植细胞数量研究显示，MRI下引发细胞信号改变的最低数量级为1×105。 结论：ESC移植免疫缺陷小鼠皮下具有成瘤性；ESC自发分化的细胞具有双核或多核多角形类似肝脏细胞的生物学形态，并同样可以表达出诸如AFP、ALB等肝脏细胞特异性标记物；合适浓度的超顺磁性氧化铁颗粒可以作为体内移植细胞良好的活体示踪剂，1×105作为细胞移植的最低移植数量既可达到移植示踪的目的又能将移植风险降至最低。 第二章:超顺磁性氧化铁颗料(菲立磁)标记ES细胞肝损伤模型体内移植研究 目的：探讨菲立磁标记ES源性自发分化细胞肝损伤模型移植的可行性，移植的最适途径，最佳移植细胞数量，了解移植细胞在体内迁徙、定居、增殖及与损伤肝脏整合、修复情况，为最终应用临床提供依据。 方法：将129/SvJ小鼠随机分为单用2-乙酰氨基芴(2-AAF)肝损伤模型和正常无肝脏损伤小鼠组。分别以1×105移植细胞数量通过门静脉、肝脏包膜下2种移植途径进行细胞移植，以菲立磁和CFDA—SE双标记法，连续动态观察移植细胞分布情况：①活体示踪：使用超顺磁性氧化铁颗粒(菲立磁)分别标记ES细胞和自发分化第day0，day3d，day9d的EBs细胞，行电子显微镜检测细胞内菲立磁包含情况，并以普鲁士蓝染色计算菲立磁标记效率，将菲立磁标记的ES细胞和自发分化EBs经上述2种途径，分别移植入肝损伤模型小鼠及对照组小鼠肝内，并定期于移植后第1天、1周、2周、3周行MRI肝脏扫描，观察移植细胞在受体内的定居增殖情况；并于移植后第1周、2周、3周，切取部分肝脏行组织病理切片并行普鲁士蓝染色。②荧光示踪：用荧光示踪剂CFDA—SE标记上述各个时段待移植ES细胞和EBs，然后经相同途径移植入肝损伤模型小鼠及正常小鼠肝内，于移植后第1周、2周定期切取模型肝脏，行组织病理切片及ALB免疫荧光化学分析，了解移植细胞在受体肝内迁徙、定居等功能表达情况。 结果：利用2-AAF制备小鼠肝损伤模型成功率较高约有84.62％(22/26)，与正常小鼠组比较以移植入2-AAF肝损伤模型小鼠中肝脏，移植细胞对肝脏的修复和整合最好；超顺磁性氧化铁颗粒(菲立磁)标记ES细胞效率达到91.5％以上，标记细胞经门静脉、肝包膜下移植到肝损伤小鼠后定期行肝脏MRI扫描，可观察到移植细胞在受体肝内能定居并进行一定地增殖；CFDA—SE荧光标记ES细胞效率可达到99.21％，体内移植后定期行肝脏病理切片，并行免疫荧光化学分析可见移植细胞在肝内定居、增殖并与受体肝板有良好整合；以第0d、3d移植入肝损模型小鼠的EBs显示，4周后肝内或腹腔内形成肿瘤。从第9d开始移植的EBs，观察4周后无瘤生成，均能较好的在受损肝脏内良好定居、增殖；本实验结果还显示，门静脉、肝包膜下2种移植途径比较，2种移植途径的优劣没有明显统计学差异。 结论：ES细胞和ES源性自发分化细胞，可以在受损肝脏定居并有一定程度的增殖，能部分修复受损肝脏；自发分化早期细胞(0d、3d)移植后具有成瘤性；以1×105数量移植ES细胞，基本能兼备良好示踪和较低移植风险，结果显示移植细胞可以定居并增殖于受损肝脏内，并一定程度地参与受损肝脏结构修复和重建；以超顺磁性氧化铁颗粒(菲立磁)标记移植细胞，通过MRI活体示踪实现了最低损伤的动态连续监测移植细胞体内的分布和功能表达情况。