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背景：胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，目前，世界范围内，每年胃癌死亡人数占肿瘤死亡人数的第2位。由于缺乏有效的早期诊断标记物以及早期患者症状不明显，大多数患者在就诊时已经处于进展期，而传统手术及化疗等对进展期胃癌疗效并不理想，导致胃癌患者总体预后较差。因此，寻找新的诊断及预后标记物，深入了解肿瘤发生、发展机制，早期诊断、早期治疗是改善肿瘤患者预后的重要手段。多年来研究证实表观遗传学调控与肿瘤发生、发展密切相关。表观遗传学调控是在不改变DNA序列的基础上，使基因获得可遗传的表型变异。包括DNA甲基化、染色质重塑、组蛋白修饰、和非编码RNA调控（短链非编码RNA-mieroRNA和长链非编码RNA-lncRNA）等。近年来，研究发现microRNA可在肿瘤的发生、发展中发挥抑癌基因的功能并且其基因启动子区的异常甲基化可能是引发肿瘤的原因之一。microRNA-497(miR-497)位于人染色体17p13.1，研究表明miR-497在多种恶性肿瘤中呈低表达状态并抑制肿瘤的侵袭、转移。但是，miR-497在胃癌中的表达和调控机制尚不明确。RAF1(Raf-1 proto-oncogene，serine/threonine kinase)具有编码Ras家族下游靶蛋白MAP3K的作用，在多种恶性肿瘤组织中高表达并与肿瘤的侵袭转移密切相关。但是，关于DNA甲基化、miR-497和RAF1这一系统研究在胃癌发生、发展中的调控机制在国内外尚未见报道。 目的：旨在探讨miR-497在胃癌中表达水平，与胃癌发生发展及临床病理学特征的关系，可能的分子调节机制，生物学功能探索，明确其调控靶基因。为研究胃癌发生、发展机制及胃癌的基因治疗和靶向治疗提供新的途径和靶点。第一部分我们检测miR-497在胃癌细胞系及胃癌组织中表达水平，分析其与临床病理学特征的关系。通过检测miR-497基因启动子区甲基化状态，分析调控其表达的相关机制及与临床病理学特征的关系。第二部分通过体内外过表达miR-497，观察其对胃癌细胞产生的生物学功能上的影响，明确miR-497对胃癌细胞的调控作用。第三部分明确miR-497的调控靶点，进一步探索miR-497发挥生物学功能的分子机制。 方法：⑴实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-497在4株胃癌细胞株及正常人胃粘膜细胞株GES-1，86例配对胃癌及癌旁组织中表达差异并进行统计学分析。⑵甲基化特异性PCR(MSP)检测胃癌细胞及胃癌组织（癌、癌旁）中miR-497基因启动子区甲基化状态，分析miR-497基因启动子区甲基化与胃癌患者临床病理学特征的关系;去甲基化药物5-Aza-2-deoxycyt idine（5-Aza-dC）对胃癌细胞株进行药物干预，MSP检测胃癌细胞株中miR-497基因启动子区甲基化状态变化;去甲基化药物5-Aza-dC，去乙酰化药物TSA对胃癌细胞株进行药物干预，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-497表达水平变化。⑶体外实验，使用胃癌SGC-7901、MGC-803细胞株，转染miR-497模拟体，外源性地过表达miR-497，通过CCK-8、划痕愈合实验、流式细胞术和Transwell小室实验分析过表达miR-497对胃癌细胞生物学功能上的影响。体内实验，构建过表达miR-497的SGC-7901稳转细胞株，建立裸鼠皮下移植瘤模型，分析过表达miR-497对小鼠体内移植瘤的生长能力的影响。⑷使用在线靶基因预测软件对miR-497的潜在靶基因进行预测，Westernblot检测miR-497靶基因在胃癌细胞及组织中的表达情况，并检测胃癌细胞中转染miR-497后其靶基因的表达变化。然后双荧光素酶报告实验对miR-497与其靶基因结合位点做进一步地鉴定，明确miR-497的直接作用靶点，最后使用靶基因的干扰RNA试验验证能否得到与过表达miR-497相似的生物学功能。进一步探索miR-497发挥生物学功能的分子机制。 结果：①qRT-PCR结果显示miR-497在4株胃癌细胞株中表达水平明显低于胃正常粘膜细胞GES-1(P＜0.05)。miR-497在86例胃癌组织中表达水平显著低于其配对癌旁组织（P＜0.01）。miR-497低表达与TNM分期（P=0.014）、淋巴结转移（P=0.016）密切相关。②MSP结果显示正常胃粘膜细胞GES-1中miR-497基因启动子区呈部分甲基化状态，而胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-497基因启动子区呈高甲基化状态。miR-497基因启动子区甲基化发生率在胃癌组织(53/86，61.6％)中明显高于癌旁组织(19/86，22.1％)，差异具有统计学意义（P＜0.05)。miR-497基因启动子区高甲基化状态与TNM分期(P=0.038)，淋巴结转移(P=0.006)显著相关。药物干预结果表明，去甲基化药物5-Aza-dC可逆转胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-497基因启动子区高甲基化状态，单独应用去甲基化药物5-Aza-dC对胃癌细胞株进行药物干预后，qRT-PCR检测发现miR-497表达水平明显升高，而单独应用TSA干预后miR-497表达变化并不明显，联合应用5-Aza-dC、TSA后，miR-497表达水平和单独应用5-Aza-dC组结果一致。③体外转染终浓度为50nM miR-497mimics至胃癌细胞株SGC-7901、MGC-803中，CCK-8实验结果显示过表达miR-497可抑制胃癌细胞增殖。流式细胞实验证实过表达miR-497能明显促进胃癌细胞凋亡。划痕愈合实验和Transwell小室实验显示miR-497过表达可抑制SGC-7901、MGC-803细胞迁移和侵袭能力。构建miR-497过表达的裸鼠模型，发现过表达miR-497可以抑制小鼠体内移植瘤的生长。④通过在线靶基因预测软件miRanda，预测RAF1可能是miR-497的靶基因，qRT-PCR和Westernblot结果显示RAF1在转染miR-497mimics后在mRNA水平和蛋白水平的表达量都有所下降，并且siRNA沉默RAF1表达后可发挥与miR-497mimics相似的生物学功能。双荧光素酶报告实验显示RAF1是miR-497的直接结合位点。 结论：⑴miR-497在胃癌细胞株与胃癌组织中呈明显低表达，miR-497低表达状态与胃癌患者TNM分期、淋巴结转移密切相关。⑵miR-497在胃癌中低表达可能与其基因启动子区高甲基化状态有关，而且miR-497基因启动子区高甲基化状态与胃癌患者TNM分期，淋巴结转移显著相关。⑶miR-497可抑制胃癌细胞增殖、促进胃癌细胞凋亡，降低胃癌细胞迁移和侵袭能力。⑷miR-497的直接调控靶基因是RAF1，通过对RAF1的调控抑制胃癌发生、发展，发挥抑癌基因的功能。