产志贺氏毒素大肠杆菌(Shigella toxin-producing Escherichia coli,STEC)是一类肠道病原体的总称,可引起全球范围内的零散感染或广泛爆发。牛是STEC最主要的宿主,STEC在其肠道内生存、繁殖,随粪便排出体外,污染食物、水源、土壤,经粪口途径传播,对人类有高致病性,可引起人类的胃肠道疾病如出血性肠炎、溶血性尿毒症,严重者还会导致死亡。O157血清型是STEC的主要致病血清型,但近年来,一些非O157血清型(如O26、O45、O103、O111、O121、O145)的流行也日益严重,在有的国家和地区甚至超过了 O157血清型。为快速、准确地检测奶牛粪便中O26、O45、O103、O111、O121、O145、O157等7种血清型的STEC,本文建立了一种富集增菌后进行多重荧光定量PCR的检测方法,可有效检出奶牛粪便中的这7种STEC,并在验证了该方法的可行性后,将此方法应用于江苏省部分地区奶牛场的粪便样品检测。1.7种血清型STEC多重荧光定量PCR检测方法的建立传统的分离培养、生化鉴定检测方法过程复杂,检测周期比较长,且容易造成漏检。本文采用Taqman探针法,建立一种多重荧光定量PCR检测方法,配合富集培养,可快速、准确地对样品进行检测。本研究将7种血清型的产志贺氏毒素大肠杆菌分为三组:①针对O157血清型,检测其高特异性O抗原基因rfbE与stx1、stx2、eae四个基因;②针对O103、O111、O121血清型,检测其wzxO103、wzxO111、wzxO121三个基因;③针对O26、O45、O145血清型,检测其wzxO26、wbqE+FO45、wzxO145三个基因。针对这三组目标血清型菌株的靶标基因,同时进行三个多重荧光定量PCR反应,即可完成对7种血清型菌株的检测。特异性试验结果显示,三组多重荧光定量PCR除阳性对照组出现目的基因扩增外,其余对照组均无扩增曲线;灵敏性试验结果显示,每个菌株的检测限浓度均达到101 CFU/mL;重复性试验结果显示,各靶基因在模板浓度相同情况下,Ct值差值小于1。以上结果证明该多重荧光定量PCR检测法的特异性好、灵敏度高和重复性好,该检测方法具有可行性。检测方法在实验室层面初步建立后,为进一步验证方法在生产上的可行性,从奶牛场采集100份奶牛粪便样品,于富集前、后分别用国际上广泛使用的多重经典PCR(cPCR)检测方法与本研究建立的多重荧光定量PCR(mqPCR)进行检测,结果显示:O26、O45、O103、O111、O121、O145、O157 等 7 种血清型,富集前 cPCR 检测法阳性率为2%、2%、3%、0%、1%、5%、1%;富集前mqPCR检测法阳性率为4%、5%、7%、1%、4%、17%、5%;富集后 cPCR 检测法阳性率为 5%、3%、6%、1%、4%、11%、2%;富集后 mqPCR 检测法阳性率为 8%、11%、10%、3%、7%、25%、7%。数据表明,多重荧光定量PCR检测前将样品进行富集培养,可有效提高样品检出率,较国际上广泛使用的多重经典PCR方法更加敏感准确。2.江苏省部分地区奶牛场粪便样品临床检测从江苏省部分地区的4个奶牛场分别采集100份奶牛粪便样品,共400份。将样品振荡培养增菌,取增菌后培养物制取DNA模板,采用本研究构建的富集增菌后多重荧光定量PCR进行检测。结果显示:O26、O45、O103、O111、O121、O145、O157等7种血清型,在A奶牛场样品中的阳性率为6%、11%、7%、0%、4%、14%、5%;在B奶牛场样品中的阳性率为9%、4%、11%、2%、8%、18%、6%;在C奶牛场样品中的阳性率为3%、5%、4%、0%、3%、27%、0%;在D奶牛场样品中的阳性率为2%、3%、2%、0%、1%、16%、0%。数据表明,4个奶牛场的优势血清型均为STEC O145,阳性率分别 14%、18%、27%、16%。综上所述,本文所建立的多重荧光定量PCR检测法灵敏度高、特异性好;江苏省不同牛场之间STEC流行情况不同。