目的:　　 1.为研究EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)多表位的真核表达情况,通过pcDNA3.1(+)真核表达载体构建了重组质粒pcDNA3.1(+)/EBV LMP2多表位,将重组质粒转染COS-7细胞,研究其真核表达情况。　　 2.以密码子优化的人乳头瘤病毒(HPV)6b结构蛋白L1(HPV6b L1△)为载体携带EBVLMP2多表位,克隆HPV6bL1△/EBV LMP2多表位的嵌合基因。构建了真核嵌合重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/EBV LMP2多表位,即人乳头瘤病毒与EB病毒嵌合DNA疫苗。并通过转染COS-7细胞,经RT-PCR间接免疫荧光,Western blot分析和电镜观察验证嵌合重组质粒在真核中的表达,及形成嵌合病毒样颗粒的情况。　　 3.通过免疫BALB/c小鼠,研究多表位重组质粒pcDNA3.1(+)/EBV LMP2和嵌合重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/EBV LMP2多表位的免疫效应,即采用ELISA检测血清IgG和阴道分泌物sIgA特异性抗体方法分析体液免疫情况；通过CTL细胞杀伤活性检测和细胞内细胞因子检测等方法分析细胞免疫情况。　　 方法:　　 1.将本实验室已筛选获得的EBV LMP2多表位的核酸序列经真核密码子优化后交由生物公司合成,并将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建pcDNA3.1(+)/EBVLMP2多表位真核重组质粒。利用转染试剂lipofectamineTM2000转染COS-7细胞,通过RT-PCR和间接免疫荧光鉴定EBV LMP2多表位的表达和定位。　　 2.设计了扩增真核密码子优化的HPV6bL1的PCR引物,并在两端设计酶切位点。先将密码子优化的HPV6bL1序列克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构成中间质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△。通过设计扩增EBV LMP2多表位的PCR引物,并将其克隆到中间质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△上,构建成嵌合重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/EBV LMP2多表位。经PCR,酶切和测序分析进行鉴定。用转染试剂lipofectamineTM2000转染COS-7细胞,通过RT-PCR,间接免疫荧光,Western blot分析鉴定HPV6bL1△/EBV LMP2多表位的真核表达,并通过电镜观察插入的EBV LMP2多表位序列是否影响HPV6bL1病毒样颗粒(VLP)的组装。　　 3.采用1、3、5周免疫程序,肌肉注射方式,重组质粒pcDNA3.1(+)/EBV LMP2多表位　　 和嵌合重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/EBV LMP2多表位免疫BALB/c小鼠,每次100μg/100μl PBS/R,同时设置对照组PBS组、pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.0(+)/HPV6bL1△组和pcDNA3.0(+)/HPV6bL1△+pcDNA3.1(+)/EBV LMP2多表位联合组,通过ELISA,CTL细胞杀伤活性检测和细胞内细胞因子检测等,分析重组质粒pcDNA3.1(+)/EBV LMP2多表位和嵌合重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/EBV LMP2多表位诱导机体产生的体液免疫和细胞免疫效应。　　 结果:　　 1.经酶切分析和测序证实多表位重组质粒pcDNA3.1(+)/EBV LMP2多表位构建成功；转染COS-7细胞后,经RT-PCR和间接免疫荧光证实了该多表位质粒在COS-7细胞的mRNA转录和蛋白的表达,且定位于胞浆。　　 2.经PCR,酶切及测序鉴定嵌合重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/EBV LMP2多表位构建成功；转染COS-7细胞后,经RT-PCR,间接免疫荧光和Western Blot分析,均证实了其可以在真核细胞中表达,且主要定位于胞浆,呈不均匀颗粒状。电镜观察显示细胞胞浆中有50-60nm的病毒样颗粒形成,提示嵌合重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/EBV LMP2多表位可在真核细胞胞浆表达,且不影响HPV6bL1病毒样颗粒的组装。　　 3.EBV LMP2多表位重组质粒诱导BALB/c小鼠产生的血清抗体经Western blot验证能特异性识别EBV LMP2多表位蛋白和EBV膜蛋白；pcDNA3.1(+)/EBV LMP2多表位和pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/EBV LMP2多表位免疫BALB/c小鼠后,ELISA结果显示其能产生对pET32a/EBV LMP2多表位的特异性IgG(末次免疫后一周达峰值,与对照组pcDNA3.1(+)组和PBS组比较,有显著性差异,p<0.05)和sIgA(末次免疫后一周达峰值,与对照组pcDNA3.1(+)组和PBS组比较,有显著性差异,p<0.05),也能产生对EBV膜蛋白的特异性IgG,且在末次免疫后1周达到峰值；pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/EBV LMP2多表位组还可以产生抗HPV6bL1 VLP的特异性IgG抗体(与对照组比较均有显著性差异p<0.05),与pcDNA3.0(+)/HPV6bL1△+pcDNA3.1(+)/EBVLMP2多表位联合组比较无统计学意义；CTL细胞活性检测结果显示小鼠核酸免疫后能产生对靶细胞的特异性杀伤作用,并随效靶比(E/T)的增高杀伤率也增高,与对照组pcDNA3.1(+)组和PBS组比较均有显著性差异(p<0.05)；流式细胞术(FCM)检测胞内细胞因子结果显示,免疫后小鼠脾淋巴细胞能够产生较高水平的IFN-γ,IL-4。　　 结论:　　 1.成功构建了重组质粒pcDNA3.1(+)/EBV LMP2多表位,并在真核细胞中得以有效地表达。　　 2.成功构建了嵌合重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/EBV LMP2多表位,在真核细胞中表达了嵌合蛋白,并可自组装形成病毒样颗粒。　　 3.pcDNA3.1(+)/EBV-LMP2多表位重组质粒能在小鼠体内产生良好的免疫效应,pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/EBV LMP2多表位免疫小鼠后,能刺激其产生细胞免疫和全身的HPV6b L1和EBV LMP2特异性的体液免疫及粘膜局部的体液免疫反应。为研究EBVLMP2多表位核酸疫苗及HPV-EBV嵌合疫苗的免疫保护效应提供实验基础。