中药北沙参多糖与单糖组成和含量测定方法研究

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中药北沙参为伞形科植物珊瑚菜(Glehnia littoralis Fr.Schmidt ex Miq.)的干燥根。本品性甘、微苦、微寒、归肺、胃经。具有滋阴清肺,益胃生津的功效。文献报道,其含有多糖类、香豆素类、磷脂、氨基酸、微量元素等多种有效成分,其中多糖类所占的比例最大,也是其主要有效成分之一。文献报道用苯酚.硫酸法对其总糖含量进行测定,关于其多糖的单糖组成的研究没有报道。本研究确定了沙参多糖的单糖组成,并对其总糖和单糖含量进行了测定,为中药北沙参多糖的质量控制标准提供了科学依据。建立了沙参多糖的提取、纯化、精制方法。采用水提取乙醇沉淀的方法提取沙参粗多糖,用石油醚除去脂类,80%乙醇除去单糖、低聚糖、苷类,Sevag法除去蛋白,对粗多糖进行纯化、精制,得到精制沙参多糖。通过Feling反应、Molish反应,紫外分光光度法等手段鉴定为不含单糖、蛋白质、核酸等物质的纯化多糖,以上结果与文献报道一致,并通过苯酚-硫酸法测定总多糖含量线性范围为1.96~6.86μg/mL(r=0.9990),平均回收率为97.6%(RSD=1.5%)。建立了确定沙参多糖的单糖组成和测定各单糖含量的柱前衍生化GC方法。用三氟乙酸水解多糖,水解产物加上衍生化试剂盐酸羟胺在吡啶中加热反应生成糖肟,加入醋酸酐为乙酰化试剂,在加热的条件下继续反应,生成具有挥发性的糖腈乙酸酯产物,采用GC色谱法,色谱柱:DM-5(30 m×0.25 mm,0.25μm);柱温:160℃→2℃/min→195℃(6 min)→10℃/min→230℃(3 min);载气:氮气;进样器温度:270℃;进样方式:分流(10:1);检测器:FID 280℃(氮气体积流量30 mL/min,氢气体积流量40 mL/min,空气体积流量400mL/min)。结果表明沙参多糖由D-鼠李糖,L-(+)-阿拉伯糖,D-甘露糖,D-葡萄糖和D-半乳糖等7种单糖组成(有2种未鉴定出)。D-鼠李糖,L-(+)-阿拉伯糖,D-甘露糖,D-葡萄糖和D-半乳糖的线性范围分别为2.4~24μg/mL(r=0.9992),6~60μg/mL(r=0.9996),1.2~12μg/mL(r=0.9991),140~1400μg/mL(r=0.9991)和6~60μg/mL(r=0.9994)。回收率分别为91.0%(RSD=2.2%),91.2%(RSD=2.2%),87.3%(RSD=3.1%),94.7%(RSD=2.3%),90.5%(RSD=2.9%)。建立了确定沙参多糖的单糖组成和测定各单糖含量的柱前衍生化HPLC-UV法。用三氟乙酸水解多糖,水解产物加上衍生化试剂1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮(PMP),采用高效液相色谱紫外检测法,色谱柱:C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:19%(v/v)乙腈-醋酸铵缓冲液(醋酸铵-冰醋酸,pH 5.5),等度洗脱;流速:1.0 mL/min;检测器:紫外检测器;检测波长:250 nm;柱温:35℃。结果表明沙参多糖由D-甘露糖,D-鼠李糖,半乳糖醛酸,D-葡萄糖,D-半乳糖和L-(+)-阿拉伯糖等8种单糖组成(有2种未鉴定出)。D-甘露糖,D-鼠李糖,半乳糖醛酸,D-葡萄糖,D-半乳糖和L-(+)-阿拉伯糖的线性范围分别为0.72~14.4μg/mL(r=0.9990),2.18~43.6μg/mL(r=0.9994),11.87~237.4μg/mL(r=0.9990),304.2~6084μg/mL(r=0.9990),14.4~288μg/mL(r=0.9990)和9.6~192μg/mL(r=0.9992),平均回收率分别为94.0%(RSD=2.5%),88.5%(RSD=2.5%),93.9%(RSD=2.3%),95.9%(RSD=2.7%),89.2%(RSD=2.5%)和90.8%(RSD=2.8%)。
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