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1.实验背景和目的：化疗耐药是目前肿瘤治疗中所面临的一个巨大挑战。目前,在肿瘤耐药机制研究中最热门的研究之一是肿瘤干细胞与化疗耐药相关性的研究。近些年来诸多证据表明许多恶性肿瘤的耐药性与其肿瘤干细胞密切相关。研究发现干细胞相关基因lin28与恶性肿瘤的发生、进展、预后以及诱导多功能干细胞形成等密切相关。另外,我们的前期研究提示lin28在多种恶性肿瘤耐药细胞株中的表达较其母代细胞株表达水平明显升高。由此,我们推测作为干细胞相关基因lin28可能与肿瘤化疗耐药相关。到目前为止,尚未见有关lin28与肿瘤化疗耐药相关性研究的报道。本研究目的旨在探讨干细胞相关基因lin28与乳腺癌细胞紫杉醇(paclitaxel, PAC)耐药的相关性,并进一步研究其可能的内在机制,为克服乳腺癌化疗耐药提供新的靶点。2.实验方法：(1)为了解lin28的表达是否与乳腺癌的化疗耐受相关,我们以western blot法检测了5株乳腺癌细胞株(SK-BR-3, MCF-7, Bcap-37, MDA-231, T47D)中lin28的表达水平,并进一步采用MTT比色法检测了该5株乳腺癌细胞株对paclitaxel的敏感性。(2)为进一步明确lin28的表达水平是否影响乳腺癌细胞对paclitaxel的敏感性,我们以lin28siRNA敲低了高表达lin28的乳腺癌细胞株T47D细胞中lin28的表达,然后采用MTT比色法检测lin28敲低前后T47D对paclitaxel的化疗敏感性的变化。(3)为进一步证实lin28的表达水平在调节乳癌细胞对paclitaxel化疗敏感性中的作用,我们建立了3株稳定表达lin28基因的SK-BR-3细胞克隆(S1,S24,S27)以及1株稳定表达lin28基因的Bcap-37细胞克隆(B1),然后采用MTT比色法检测上述稳定表达lin28基因的细胞克隆对paclitaxel的化疗敏感性的变化。(4)同时,采用流式细胞技术检测paclitaxel对上述in28稳定表达细胞克隆的凋亡的影响。(5)以western blot法检测paclitaxel作用lin28稳定表达细胞株S24中PARP的表达,进一步验证lin28抑制paclitaxel对乳癌细胞的凋亡诱导作用。(6)我们以免疫组化法检测了乳癌复发转移组织及新辅助化疗前后乳癌组织中lin28表达的变化,以了解lin28的表达与肿瘤对化疗敏感性的关系。(7)为探讨lin28诱导乳腺癌paclitaxel耐药的可能机制,我们以western blot法检测了SK-BR-3/mock细胞株及其lin28稳定表达细胞克隆S1,S24,S27中MRP-1耐药蛋白以及p21,Rb, cyclib1和AKT等恶性肿瘤重要分子通路基因的表达。(8)为进一步探究lin28诱导乳癌paclitaxel耐药的机制,我们以real-time PCR法检测了SK-BR-3细胞株及其lin28稳定表达细胞克隆S1,S24,S27中lin28的下游调控分子let-7miRNA的表达水平。(9)为进一步明确let-7miRNA在介导lin28诱导乳癌细胞paclitaxel化疗耐受中的作用,我们将pre-let-7a miRNA转染到lin28稳转细胞株S1中,提高S1细胞中let-7miRNA的表达后,MTT比色法检测该细胞克隆对paclitaxel的敏感性的变化。3.实验结果：(1)5株乳腺癌细胞株(SK-BR-3, MCF-7, Bcap-37, MDA-231, T47D)中,T47D细胞的lin28表达水平明显高于其他细胞株,经paclitaxel作用后的IC50值(48.20μM)也明显高于其他细胞株(4.40μM～9.80μM)。(2)T47D细胞以siRNA特异性敲低lin28的表达水平后,测paclitaxel作用的IC50值明显低于对照组(p<0.05)。(3)Lin28稳定表达的乳腺癌细胞克隆(S1,S24,S27)对paclitaxel的敏感性低于对照组。其IC50值分别为：22.30μM (S1),32.30μM (S24)和35.60gM(S27)。对照组的IC50值为：9.90μM。此外,western blot的检测结果表明,在lin28稳定表达的三株细胞克隆中,S27的表达强度最强,S1的表达最弱,与其对paclitaxel的敏感性呈负相关。同样,在另外一株乳腺癌细胞株Bcap37稳定表达lin28的细胞克隆B1也发现：与对照细胞株(Bcap37/mock)相比,lin28稳定表达细胞株对paclitaxel更耐药。Bcap37/mock的IC50值为6.10μM,而在其稳定表达lin28的Bcap37克隆B1的IC50值为28.30μM。(4)乳腺癌细胞转染lin28后,paclitaxel诱导的细胞凋亡率明显下降。对lin28稳转的SK-BR-3克隆的流式检测(PI单染法)显示：10μM paclitaxel作用48小时后细胞凋亡率从50.78%(对照组SK-BR-3/mock)下降至20.47%～30.32%(转染组S1,S24,S27);40μM paclitaxel作用48小时后细胞凋亡率从69.88%(对照组SK-BR-3/mock)下降至27.61%～36.92%(转染组S1,S24,S27)(p<0.01). PI-AnnexinV双染法检测也得到了类似的结果：10μM and40μm紫杉醇作用下,lin28稳定表达的细胞克隆S24的细胞凋亡率均明显下降,分别为：42.27%降至17.62%(10μM),58.81%降至24.71%(40gM)(p<0.01)。结合单染和双染的结果,我们可以发现S24细胞经紫杉醇作用后的死亡细胞中,凋亡细胞所占的比例为75-80%。同样,另外一株lin28稳定表达克隆B1经paclitaxel处理后发现：Paclitaxel的浓度为5μM时,细胞死亡率从28.30%降至5.12%,当paclitaxel的浓度为20μM时,细胞死亡率从32.85%降至8.56%(5) Western blot检测结果显示在母代细胞及对照细胞中,经紫杉醇作用后,PARP的裂解产物表达增加,而lin28稳定表达细胞S24中PARP的裂解产物表达无明显变化。(6)免疫组化的检测结果发现,与新辅助化疗前比较,在新辅助化疗后乳腺癌组织中lin28的表达水平明显增高。而且,结果显示在转移和复发乳腺癌标本中lin28的表达水平明显高于新辅助化疗前乳腺癌组织以及新辅助化疗后乳腺癌组织。(7)Lin28稳定表达的细胞株中MRP-1的表达无明显变化,细胞周期相关蛋白P21和细胞凋亡相关基因Rb的表达升高。(8)Lin28稳定表达的细胞株中let-7a和let-7b miRNAs的表达明显下降。(9)将pre-let-7a miRNA转入Lin28稳定表达的细胞株S1中,paclitaxel的IC50值明显下降(p<0.01)。4.结论：(1)Lin28的表达水平与乳腺癌细胞对paclitaxel的耐受性正相关。(2)细胞转染lin28基因后可诱导乳癌细胞对paclitaxel耐药。(3)lin28通过抑制乳癌细胞的凋亡而诱导紫杉醇耐药(4)新辅助化疗后乳腺癌组织中lin28表达增高,复发转移乳癌组织中lin28的表达水平高于原发灶。(5)Lin28可诱导乳癌细胞中p21和Rb的表达。(6)Lin28可抑制乳癌细胞中let-7miRNAs水平(7)提高lin28稳定表达乳癌细胞株中let-7a的水平可以逆转该细胞对paclitaxel的耐受性。我们的研究结果表明lin28可能是导致乳腺癌paclitaxel耐药的机制之一。lin28诱导乳腺癌细胞对paclitaxel耐药的分子机制可能与其提高乳腺癌细胞中p21和Rb的表达及抑制let-7miRNA有关。