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随家畜人工授精技术的推广和应用,优秀种公羊的选育对于肉用绵羊繁育的作用越来越重要。目前,限于种公羊资源群建设的困难性,有关种公羊的精液品质性状分的群体遗传学的报道及其稀少,目前尚未见关于绵羊SPATA7、SPATA16、SPEF2基因遗传多态性与精液品质性状关联性分析的任何报道。近年来,本课题组与河南中鹤牧业有限公司合作,已成功组建了多个品种肉用绵羊公羊资源群,对公羊精液品质相关的部分候选基因进行了群体遗传学研究。在此基础上,本研究首先以4个品种的公羊为研究对象,对SPATA7、SPATA16、SPEF2基因的遗传多态性及其与种公羊精液品质的关联性进行分析,旨在筛选与精液品质相关的SNPs位点,揭示这些基因位点的群体遗传特征,为应用分子标记辅助选择改善种公羊精液品质提供理论依据。其次,在日粮中添加GAA,探讨其对精液品质的改善作用,进而克服中原地区肉羊生产中广泛存在的种公羊不育现象提供理论依据。(1)变异位点鉴定:采用DNA混池测序法,对研究群体中精子发生相关基因SPATA7、SPATA16基因以及与精子结构有关的SPEF2基因的遗传多态性进行鉴定,共检测到43个多态位点。具体来说,在SPATA7基因检测到11个多态位点,其中9个为内含子突变,1个UTR区域的16bp插入/缺失突变,1个错义突变。在SPATA16基因检出3个同义突变和9个内含子突变。在SPEF2基因检出2个UTR突变、3个错义突变及15个内含子突变。(2)群体遗传特性分析:利用飞行时间质谱生物芯片系(Sequenom Mass Array)法进行个体基因分型,进行群体遗传特征分析。主要结果为:1 SPATA7基因:对8个位点进行分析,结果表明,rs161954996G>A位点在4个研究群体中未检到突变基因型;除rs595936513A>G位点处于低度多态、低度杂合外,其它位点均处于中度多态、中度杂合状态。除rs595936513A>G外,其余7个位点均符合Hardy-Weinberg平衡。2 SPATA16基因:对10个位点分别进行分析,除rs422481856A>G、rs427627457A>G、rs400591110C>T位点处于中度多态、中度杂合外,其余位点均处于低度多态、低度杂合状态。除rs422481856A>G、rs427627457A>G、rs400591110C>T外,其余位点均不符合Hardy-Weinberg平衡。3 SPEF2基因:对18个位点进行分析,除rs409270318A>G位点处于低度多态、低度杂合外,其它位点均处于中度多态、中度杂合状态。除rs400981214C>T、rs405869686A>G、rs409270318A>G、rs420463053T>C、rs421390194C>T外,其余位点均符合Hardy-Weinberg平衡。(3)SNP与精液品质的关联性分析:对3个基因的重要SNP位点与公羊精液品质性状进行关联分析,结果如下:(1)SPATA7基因的rs415416547A>G位点的AA基因型的精液量有显著高于AG型和GG型的趋势(P=0.089);AA基因型的路径速度(VAP)、直线速度(VSL)显著高于GG基因型(P<0.05)。rs418082626A>G位点的GG基因型的精液量极显著高于AA和AG基因型(P<0.01);GG基因型的VSL显著高于AA基因型(P<0.05)。rs599404794位点-/-基因型的VSL有显著高于-/+基因型的趋势(P=0.063)。(2)SPATA16基因的rs408318574C>T、rs425333178C>T、rs428462879C>T位点三个基因型的顶体完整率(P=0.058)和精子活力(P=0.093)有显著差异的趋势。(3)SPEF2基因的rs399938665A>G、rs400991588A>G位点的三种基因型的精子活力有差异显著的趋势(P=0.072,P=0.07);rs400991588A>G位点GG基因型的精子活率显著低于AA型和AG型(P<0.05)。rs407363126T>G位点的TT基因型的精子活率显著低于GT型和GG型(P<0.05)。rs407524184A>G位点的顶替完整率在三种基因型间可能存在较大差异(P=0.088)。rs419749948A>G位点AA基因型的精子活率显著低于AG型和GG型(P<0.05)。(4)单倍体型与精液品质性状关联性分析:对各基因重要SNPs进行单倍体分析,结果为:(1)SPATA7基因的3个位点rs418082626、rs422662838、rs428090770存在8种单体型,A-G-G是精子顶体发育完整性的有利单倍体型(P<0.05)。(2)SPATA16基因的3个位点rs398311646、rs400591110、rs408318574存在7种单体型,A-C-C是精子顶体发育完整性的有利单倍体型(P<0.05)。(3)SPEF2基因的3个位点rs407363126、rs407524184、rs407899691存在8种单体型,G-G-T是精子顶体发育的有利单倍体型(P<0.05)。(5)SNP与公羊血液生理生化指标进行关联分析:(1)SPATA7基因:rs409407645A>G位点,AA基因型的淋巴细胞绝对值(LYM)、淋巴细胞比率(LYM%)和中性粒细胞百分比(Gran%)、中性粒细胞绝对值(Gran)均显著高于AG型。AA基因型的血小板计数(PLT)显著低于的AG基因型(P<0.05)。GG基因型的血小板压积(PCT)显著高于AA型(P<0.05)。片段插入/缺失rs599404794位点及rs428090770A>G位点的三种基因型的血清尿素有显著差异(P<0.05)。rs409407645A>G位点AG和GG基因型血清葡萄糖含量极显著高于AA型(P<0.01)。(2)SPATA16基因的rs408318574C>T位点、rs425333178C>T位点的三种基因型的血小板计数PLT有显著差异(P<0.05)。rs410515272T>G位点TT基因型的中性粒细胞绝对值Gran、血红蛋白HGB、红细胞总数RBC、平均血红蛋白含量MCH较其它两个基因型有显著差异(P<0.01或P<0.05)。rs604103514A>G位点的GG基因型的Gran、HGB较其它两个基因型有显著差异(P<0.01或P<0.05);血清尿素,AG>GG(P<0.05)。(3)SPEF2基因的rs400981214C>T位点的CC型是LYM%、RBC和血清Mg的优势基因型(P<0.05)。rs405869686A>G位点GG基因型的中间细胞比率(Mid%)显著高于AA和AG型(P<0.05)。AA型是PLT、血小板分布宽度(PDW)的优势基因型(P<0.01;P<0.05)。rs413789102C>T位点CC基因型的RBC和血清Mg显著高于CT和TT型(P<0.05)。rs421390194C>T位点的TT基因型的Mid%显著高于CC和CT型(P<0.05);CC基因型的PLT、PDW与CT和TT型有显著差异(P<0.01;P<0.05)。rs406155807C>T位点TT基因型血清ALT显著高于CT和TT型(P<0.05)。rs407899691C>T位点CT基因型血清P显著低于CC和TT型(P<0.05)。(6)胍基乙酸(GAA)添加对公羊精液品质的影响:为验证胍基乙酸对公羊精液品质的影响,在公羊日粮中添加0.1%和0.2%GAA,结果表明,胍基乙酸都可显著改善精液品质低下公羊的精力活力,添加后1-2月左右公羊精子活力可基本恢复正常;添加0.1%GAA效果稳定,成本较低。综上所述,本研究采用DNA混池测序法,对绵羊SPATA7、SPATA16和SPEF2的43个SNPs进行遗传多态性分析。SPATA7基因的rs418082626A>G位点与精液量密切相关;SPEF2基因的rs400991588A>G、rs407363126T>G、rs419749948A>G位点均与精子活率密切相关。SPATA7基因的A(rs418082626)-G(rs422662838)-G(rs428090770)、SPATA16基因的A(rs398311646)-C(rs400591110)-C(rs408318574)、SPEF2基因的G(rs407363126)-G(rs407524184)-T(rs407899691)均与精子顶体完整率密切相关。这3个候选基因的若干SNPs与多项血液生理生化指标密切相关。在公羊日粮中添加0.1%的GAA对精液品质有明显的改善作用。因此,绵羊SPATA7、SPATA16、SPEF2基因存在丰富的多态性,某些位点的基因型可能与公羊精液品质性状连锁,有望作为分子标记应用于肉羊育种。在公羊日粮中添加GAA,可有效改善公羊的精液品质。