论文部分内容阅读
由子囊菌门真菌稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病(Rice Blast Disease)是水稻上为害严重的几种病害之一,每年稻瘟病在世界范围内造成重大的水稻产量损失,平均达到水稻总产量的30%左右。当前对于水稻稻瘟病最为绿色有效的防治方法是抗病品种的选育,但是由于病菌遗传变异快以及田间选择压力的影响,田间易形成新的毒力群体,从而使抗病品种失效。因此,我们有必要对稻瘟菌致病过程的分子机制进行研究,以期为绿色农药的靶标开发提供理论依据。随着稻瘟菌基因组数据的公布,加速了科研工作者对稻瘟菌致病过程中一些重要基因的功能研究,至今已有大量稻瘟菌致病过程的机理得到详细地解析。泛素化修饰是真核细胞中一种十分保守且非常重要的蛋白质翻译后修饰作用,参与到多种细胞学过程中,包括蛋白酶体介导的蛋白降解,DNA损伤修复,内吞作用,信号转导等。泛素化修饰能够可逆地被去泛素化酶(Deubiquitinase)水解,从而达到对细胞内蛋白质泛素化修饰精准的调控。有报道称在模式病原真菌稻瘟菌(M.oryzae)中,泛素化过程在其生长,发育,致病过程中发挥重要作用,然而对于去泛素化酶在其致病过程中的作用却未见报道。本研究初期,在稻瘟菌中鉴定到一个酵母去泛素化酶UBP14基因的同源基因,将其命名为MoUBP14。通过同源重组的策略,在稻瘟菌中定向将MoUBP14基因进行敲除,并对突变体菌株的生物学表型以及该蛋白的分子功能进行了初步的研究。研究结果表明,MoUBP14基因敲除后,敲除体致病力发生严重衰退,菌丝营养生长明显缓慢,产孢量严重下降,附着胞发育缓慢,附着胞膨压明显降低,对环境胁迫条件更加敏感,碳源代谢存在缺陷。在总蛋白水平上,ΔMoubp14敲除体细胞内游离泛素链含量更高,即敲除体中泛素化水平发生紊乱。通过Pulldown试验,鉴定到在糖异生途径中两个关键限速酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(Pck1),果糖-1,6-二磷酸酶(Fbp1)是MoUbp14蛋白的结合蛋白,实验结果显示Fbp1、Pck1在敲除体中的泛素化水平有升高趋势,表明其可能是MoUbp14去泛素化酶的去泛素化底物。在葡萄糖诱导糖异生途径酶降解过程中,敲除体中Pck1和Fbp1蛋白丰度明显较野生型高,证明了Ubp14参与到UPS(泛素蛋白酶体系统)介导的Fbp1和Pck1降解过程中,说明Ubp14有可能参与到对碳源代谢基因的调控从而影响稻瘟菌的生长发育和致病过程。本文初步研究了去泛素化酶MoUbp14在植物病原真菌稻瘟菌致病过程中的功能,明确了其去泛素化功能在稻瘟菌生长、产孢、附着胞发育、抗逆和碳源代谢等方面发挥着广泛的作用,也为更进一步研究其它去泛素化酶提供了坚实的实验基础和理论支持。