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目的:前期抽取30名非综合型唇腭裂的患儿血样,通过全外显子测序等生物信息技术寻找非综合型唇腭裂可能候选致病基因,筛选出突变率最高LAMA5基因rs145192286位点。本研究依靠前期的实验基础,探究其LAMA5基因与非综合型唇腭裂之间的关系。观察层粘连蛋白-5(LAMA5)在小鼠胚胎腭器官发育融合过程中的时空表达变化,利用RNAi技术靶向干扰LAMA5基因,观察腭突融合情况,了解特异性抑制靶基因下对于胚胎腭突发育融合的影响。方法:1.用断颈脱位法在C57BL/6J孕鼠妊娠第12.5天(E12.5)、E13.5、E14.5、E15.0、E15.5处死,保留小鼠胎头,应用免疫组织化学染色和Western Blotting法定位、半定量检测LAMA5蛋白在不同胚胎发育时期在腭突中的表达。2.建立体外腭器官培养模型,设计抑制LAMA5基因表达尾部带有绿色荧光标记物的shRNA腺病毒载体,将其导入E13.5体外培养腭突组织中,培养48h后倒置荧光显微镜下观察腭突融合情况,运用实时荧光定量PCR和Western blotting技术从mRNA水平和蛋白质水平分别检测干扰后的基因LAMA5表达量变化。结果:1.免疫组织化学显示LAMA5主要定位在基底膜上,基底膜属于特殊的细胞外基质。胚胎E12.5和E13.5时表达在腭中嵴上皮的基底膜上,表达量高,呈连续高强度染色;E14.5表达量较E13.5时明显减少,仅在腭突及邻近口腔和鼻腔面的细胞外基质有表达;E15.0仅仅在接触的腭中缝表达,随着腭突融合E15.5未见LAMA5表达。结合半定量吸光度值测定免疫组织化学染色结果,吸光度值随着腭突逐渐发育至成熟期间,数值逐渐降低,表达量也降低,且每组与前一组相比均有显著表达统计学差异(P<0.05)。Western Blotting显示LAMA5在E12.5时表达最多,E15.5时表达最少。在E14.5时表达明显比E13.5时减少,有差别统计学意义(P<0.05)。Western blot检测和免疫组化检测结果趋势一致。2.经过48h后LAMA5-shRNA3转染组和EGFP-NC对照组两侧腭突向中间聚拢并逐渐融合。LAMA5-shRNA1组和LAMA5-shRNA2组经过病毒转染后两侧腭突未融合,两侧腭突间仍有间隙。PCR结果表示,LAMA5-shRNA1组和LAMA5-shRNA2组的与HBAD-EGFP-NC对照组相比分别减少了63.7%和48.1%,有明显统计学意义(P<0.05)。而LAMA5-shRNA3实验组并未有明显的下降,表达量没有区别性差异(P>0.05)。Western blot检测和PCR检测结果趋势一致。结论:LAMA5在腭发育的关键阶段有表达变化趋势。构建腺病毒载体沉默抑制LAMA5引起腭裂发生,证明LAMA5与腭裂发生有关。因此我们推测LAMA5可能是NSCL/P新的候选致病基因,同时也为后续作用机制及信号通路等的研究奠定基础。