【摘 要】
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目的:溃疡性结肠炎是一种容易复发的炎症性肠病,其发病率逐年上升。本研究旨在探明Orai1通道在实验性结肠炎肠上皮屏障功能损伤中的作用。方法:我们使用TNF-α诱导NCM460细胞炎症模型,免疫印迹检测Orai1、Orai2、Orai3、PKD2、Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7等相关蛋白的表达;免疫共沉淀检测Orai1与Claudin-1、Claudin-4、Claudi
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目的:溃疡性结肠炎是一种容易复发的炎症性肠病,其发病率逐年上升。本研究旨在探明Orai1通道在实验性结肠炎肠上皮屏障功能损伤中的作用。方法:我们使用TNF-α诱导NCM460细胞炎症模型,免疫印迹检测Orai1、Orai2、Orai3、PKD2、Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7等相关蛋白的表达;免疫共沉淀检测Orai1与Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7的相互作用;免疫荧光对Orai1与Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7之间进行共定位;细胞划痕实验检测NCM460细胞的迁移能力;荧光素渗透实验检测上皮细胞间隙通透性;钙离子成像实验检测细胞内钙离子浓度变化。使用DSS建立小鼠实验性结肠炎模型,免疫印迹检测Orai1、Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7等相关蛋白的表达;Tunel染色检测结肠组织上皮细胞凋亡情况;免疫组织化学染色检测Orai1、Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7等相关蛋白的组织学定位与表达;HE染色检测其结肠组织病理学损伤程度。结果:与对照组相比,TNF-α诱导NCM460细胞炎症模型中,胞内钙离子浓度升高,Orai1、Orai2、PKD2蛋白的表达量增加,Orai3、Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7蛋白的表达量下降;Orai1蛋白与Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7蛋白之间存在相互作用以及共定位;Orai1抑制剂能有效增强细胞间的紧密连接并减弱迁移能力,以及能降低细胞间隙通透性;DSS诱导的实验性结肠炎小鼠模型中,与对照组相比,造模组小鼠体重明显减轻,出现血便,荧光素渗透率明显增加,表明其黏膜屏障可能存在损伤,HE染色中发现其黏膜确有损伤,结肠上皮细胞凋亡增加,Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7蛋白的表达降低,Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7的磷酸化水平升高,而Orai1抑制剂治疗组的小鼠体重减轻有所改善,血便出现延迟,荧光素渗透率也明显降低,HE染色中发现其黏膜损伤有所改善,说明Orai1抑制剂可上调Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7等蛋白的表达,降低Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7的磷酸化水平,减少结肠上皮细胞的凋亡,减轻结肠黏膜的病理损伤。结论:1.在TNF-α诱导炎症模型的NCM460细胞中,Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7与Orai1可以形成复合物;Orai1抑制剂降低Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7的磷酸化水平,上调Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7蛋白的表达,增强结肠上皮屏障功能。2.在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中,模型组小鼠结肠黏膜通透性增加,Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7磷酸化水平升高,Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7表达降低,Orai1抑制剂能上调Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7等蛋白的表达,并减弱其磷酸化水平,降低结肠黏膜通透性。
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