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背景与目的胃内容物含有胃酸、胃蛋白酶(pepsin)、胆汁酸和食糜等,反流至咽喉可造成粘膜损伤,胃蛋白酶是其中主要的损伤介质,但损伤机制仍未明确,细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平增高和NOD样受体家族蛋白-3 型炎症小体(NOD-like receptor family protein-3 inflammasome,NLRP3)的激活可能与之相关。ROS是细胞内带高能电子的含氧化合物,生理状态下参与能量代谢、免疫反应等细胞活动,病理条件下ROS含量异常可导致氧化应激,损伤细胞结构、介导慢性炎症,硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)是参与ROS水平调节和氧化应激信号传递的重要蛋白质。NLRP3炎症小体是细胞内的蛋白聚合体,可以被ROS等细胞内外刺激信号活化,激活半胱天冬蛋白酶1(caspasel),进而剪切底物前体炎性细胞因子IL1β、IL18并介导炎症。我们的前期研究表明pepsin刺激可以介导喉上皮细胞IL1、IL8转录增高,ROS水平提高。在本研究中我们提出pepsin通过ROS-NLRP3通路介导炎症,是LPR损伤喉粘膜的重要机制。材料与方法选用人永生化室带、声门下细胞株进行pepsin刺激实验,通过二氢乙啶(dihydroethidium,DHE)染色荧光法检测ROS水平并定量;提取细胞总蛋白,免疫印迹法(western blot,WB)检测 TXNIP、caspase1、IL1β、IL18 蛋白及相应剪切体的表达水平,实时荧光定量PCR检测转录水平改变;分别用Apocynin、DPI、Tempol等3种ROS抑制剂及NLRP3特异性抑制剂MCC950进行预处理后,观察抑制ROS、NLRP3对pepsin损伤作用的影响。收集LPR相关喉部病变患者的环后区非病变粘膜,冰冻切片检测其ROS水平,石蜡包埋切片免疫组化监测其pepsin、caspase1、IL1β、IL18蛋白表达水平,并分析pepsin与ROS、caspase1、IL1β、IL18 的相关性。结果1.Pepsin 上调 ROS 及 TXNIP 水平Pepsin刺激永生化喉上皮细胞5h×2d后,DHE染色荧光定量显示永生化喉上皮细胞ROS水平增高;WB检测提示TXNIP表达水平增高。2.Pepsin上调caspasel、IL1β蛋白剪切体表达水平刺激条件同前,WB结果显示caspases1、IL1β的成熟形式(剪切体)c1-caspase1、cl-IL1 β表达增高,IL18及其剪切体表达无明显组间趋势。3.ROS抑制剂对pepsin刺激的保护作用分别预孵育 3 种 ROS 抑制剂(Apocynin、DPI、Tempol)1h 后进行 pepsin刺激实验,结果显示3种抑制剂均不同程度抑制pepsin上调ROS,Apocynin作用最明显;Apocynin抑制ROS后,caspases1、IL1β的剪切活化水平明显减弱。4.MCC950对pepsin刺激的保护作用预孵育MCC950特异性抑制NLRP3炎症小体1h后进行pepsin刺激实验,caspases1、IL1β的剪切活化水平明显降低,DHE染色亦显示ROS水平上调被抑制。5.喉部病变患者喉粘膜pepsin与ROS、caspase1、IL1β水平相关免疫组化结果示,20例LPR相关喉部病变患者中喉粘膜pepsin表达阴性者6例,阳性14例,据此分组。pepsin阳性组ROS水平、Caspase1及IL1β表达水平明显高于阴性组,两组IL18水平未见显著性差异;研究对象的ROS水平、Caspase1、IL1β积分与pepsin积分具有相关性。结论Pepsin刺激使永生化喉上皮细胞ROS水平和TXINP蛋白表达上调,NLRP3炎症小体活化从而使炎性细胞因子IL1β表达增高,ROS抑制剂Apocynin及NLRP3抑制剂MCC950均能显著抑制pepsin上调ROS和活化NLRP3的作用。LPR相关喉部病变患者喉粘膜pepsin表达阳性率较高,pepsin表达水平与喉粘膜的ROS、Caspase1、IL1β水平相关。ROS-NLRP3通路激活引起IL1β成熟增多可能是pepsin刺激介导喉粘膜的损伤重要炎症机制。