绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,M.O)能够引起绵羊和山羊的传染性胸膜肺炎,并且同仅引起山羊传染性膜肺炎的丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoide subsp.capri)无交互免疫性。M.O自1982年首次在国内发现后,对我国养羊业造成了重大危害。本研究在M.O山东分离株鉴定的基础上,调查了山东省部分羊场的感染情况,并阐明了M.O标准株Y-98外膜蛋白的特性和探讨了快速诊断M.O的PCR方法,为山东省M.O感染的防治提供了一定的技术支持。本研究共分四个部分:第一部分绵羊肺炎支原体山东YG株的分离与鉴定从山东某羊场采集因传染性胸膜肺炎死亡的绵羊肺、胸腔渗出液等检样,应用Hartleys培养基进行病原体分离培养。将分离到的病原体采用微生物学、血清学、电镜观察方法及理化特性进行鉴定,结果表明,分离的病原体表现出同M.OY-98标准株完全相同的特征,故确定为绵羊肺炎支原体(命名为山东YG株)。将分离株经气管接种进行绵羊回归试验,出现与临床病例完全相同的症状,表明YG株M.O是造成绵羊发病和死亡的病原体。将YG株M.O接种到SPF鸡胚卵黄囊中,结果表明其可以在卵黄囊中生长,并且造成鸡胚的发育缓慢和死亡。用电镜观察,YG株M.O主要表现为二等分裂的繁殖方式,部分表现为出芽生殖。另外,观察到M.O的细胞膜呈三层结构,外面为绒毛状荚膜。第二部分IHA对山东省部分羊场M.O的血清学调查使用M.OY-98株制备IHA诊断抗原,对山东省济南、莱芜、聊城和东营四地市7个羊场共898只不同品种、年龄的山羊和绵羊进行了血清学调查,以IHA效价26以上判为阳性。结果表明,各个羊场中均存在着的M.O感染,不同品种、年龄的羊只感染率不同。在898份被检血清中,阳性检出率为28.9%,其中绵羊和山羊的阳性率分别为32%和24.3%,表明绵羊阳性率明显高于山羊;一岁以下羊只阳性率为42.8%,明显高于其他年龄的羊只,说明此年龄羊只最易感;波尔山羊阳性率为48.3%,杜泊绵羊阳性率为47.9%,明显高于当地普通羊和杂交羊的22.5%和27.6%。第三部分绵羊肺炎支原体外膜蛋白特性研究首先通过电镜观察到M.O细胞膜结构和荚膜的存在,然后采用TritonX-100裂解和0.6% KI提取的方法制备绵羊肺炎支原体Y-98株外膜蛋白,经12%SDS-PAGE分析,表明其分子量范围在14.4-125.9KD之间。分别制备抗Y98株全细胞抗原和外膜蛋白高免血清,经Western-blotting分析,表明外膜蛋白为绵羊肺炎支原体的主要保护性抗原,而在外膜蛋白的67.6KD、39.3KD和28.8KD多肽为其主要保护性抗原。利用间接ELISA方法对外膜蛋白引起的体液免疫功能进行测定,结果表明,膜蛋白能够诱导机体产生高效价的抗体,免疫后第7、14和28天抗体效价分别达到了1:24.25、1:27.75和1:28.75;利用MTT法对外膜蛋白引起的细胞免疫功能进行测定,结果表明,在免疫前0天及免疫后28天对T淋巴细胞刺激的转化率分别为8.46%和18.3%。以MDCK为研究载体,待MDCK贴壁生长后接种不同浓度的外膜蛋白和M.OY-98,细胞出现CPE或者脱落,而抗外膜蛋白高免血清可以有效地抑制CPE和细胞脱落的发生。第四部分快速检测M.O的PCR方法的建立和初步应用根据GenBank发表的支原体保守序列,使用Primer6.0设计一对支原体的通用引物,扩增大小约为453bp的支原体保守序列。应用该引物对绵羊肺炎支原体Y-98、分离株YG、鸡滑膜支原体(MS)、鸡败血支原体(MG)、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌分别用该引物进行PCR扩增,结果表明,该引物能够从MOY-98、分离株YG、MS和MG中特异性扩增出453bp的片段,而不能从肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌中扩增出该片段。将M.ODNA进行倍比稀释,进行敏感性试验,结果表明该引物能够检测出1pg/ml浓度的DNA,具有较强的敏感性。分别以M.OY-98、分离株YG培养液、M.OYG接种致死的鸡胚卵黄囊为材料,进行PCR,结果表明,均能够特异性扩增出453bp的片段。