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第一部分毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱通过抑制SK-N-SH细胞APP的表达抑制Aβ的产生目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种逐渐进展的神经系统退行性疾病,其特征为逐渐加重的痴呆和认知功能的障碍。AD最为显著的组织学特征为大脑皮质细胞外出现由β类淀粉多肽（amyloidβ,Aβ）积聚构成的老年斑（senile plaques,SP）。β淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白,APP经β分泌酶和γ分泌酶水解能够产生Aβ。β分泌酶和γ分泌酶是APP水解产生Aβ的关键酶,能够调控Aβ的产生。以往研究发现中药海风藤提取成分毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱能有效抑制人神经母细胞瘤细胞（SK-N-SH细胞）的APP的蛋白表达水平,但是该药是否能够最终影响Aβ的水平以及β分泌酶和γ分泌酶的活性,需要进一步实验证实。本实验着重研究中药海风藤提取物毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱能否抑制SK-N-SH细胞的Aβ产生和药物对β分泌酶和γ分泌酶的影响,以及药物可能的作用机制。方法:用生药学的萃取和层析方法从中药海风藤中提取了毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱（1:0.8）成分,然后用浓度3.13μg/mL,6.25μg/mL和12.50μg/mL的毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱处理SK-N-SH细胞22小时。之后,分别采用MTT法检测细胞活性和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）释放法检测药物对细胞毒性的影响。采用Western Blot法检测SK-N-SH细胞Aβ42和Aβ40多肽的表达,酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测SK-N-SH细胞Aβ42和Aβ40的产生的浓度。另外,采用Western Blot法检测APP、Notch胞内区多肽（Notch1）和β-位APP切割酶（BACE-1）蛋白的表达。同时,采用免疫细胞化学染色法检测SK-N-SH细胞Aβ42的表达。另外,采用荧光分析法检测药物对SK-N-SH细胞β-分泌酶和γ-分泌酶活性的影响。结果:实验结果显示,实验浓度的毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱（3.13μg/mL,6.25μg/mL和12.50μg/mL）和0.1%DMSO对SK-N-SH细胞的活性无明显影响,无明显的细胞毒性（P＞0.05）。实验浓度的毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱（3.13μg/mL,6.25μg/mL和12.50μg/mL）能有效抑制SK-N-SH细胞APP蛋白的表达和减少Aβ42和Aβ40肽的产生（P＜0.05）,这种作用与药物溶剂0.1%DMSO无关。免疫细胞化学染色检测发现经毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱处理的SK-N-SH细胞Aβ42表达显著减少（P＜0.05）。但是对SK-N-SH细胞的BACE-1蛋白的表达和Notch1蛋白的表达无明显影响（P＞0.05）。实验浓度的毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱对SK-N-SH细胞的β-分泌酶和γ-分泌酶的活性无明显影响（P＞0.05）。结论:实验结果提示浓度为3.13μg/mL,6.25μg/L和12.50μg/mL的毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱复合物能有效的通过抑制APP蛋白的表达,减少SK-N-SH细胞Aβ42和Aβ40多肽的产生。各浓度的毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱不能影响SK-N-SH细胞的β-分泌酶和γ-分泌酶的表达和活性。第二部分毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱抑制SK-N-SH细胞β类淀粉前体蛋白基因启动子主要启动调控区蛋白结合活性及机制研究目的:Alzheimer病（Alzheimer’s disease,AD）即阿尔茨海默病,又称老年性痴呆,是一种逐渐进展的神经变性疾病。AD最为显著的组织学特征为大脑皮质细胞外出现由β类淀粉多肽（amyloidβ,Aβ）构成的老年斑。β淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）经β分泌酶和γ分泌酶水解能够产生Aβ。APP基因定位于人类21号染色体2区1带,APP基因的表达主要由其启动子调控,还受到激活蛋白-1（activator protein-1,AP-1）和白介素-1（interleukin-1,IL-1）的调控。在APP的启动子内,起主要作用的是APP基因的启动调控区（proximal promoterregion,PPR）,位于其翻译起始位点上游-46至-1碱基之间。在APP的PPR区内有7个碱基也同时为AP-1的结合位点（TGA CTC G）,能够接受AP-1的调节。夏文等采用RT-PCR法和Western Blot法证实了从海风藤中提取的毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱组成成分能够有效的选择性地抑制SK-N-SH细胞APP基因mRNA和蛋白的表达。为了研究毕拨明宁碱和二氢毕拨明宁碱抑制APP基因表达的可能的机制,本课题通过凝胶电泳阻滞实验（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）研究药物毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱对SK-N-SH细胞APP启动子PPR区的蛋白结合活性的影响,同时观察药物对AP-1探针与核蛋白结合能力的影响。另外,在本研究中,还检测了药物对IL-1β,c-Jun,c-Fos和APP蛋白表达的影响,以探讨药物作用的可能的机制。方法:用生药学方法从中药海风藤的水提物浸膏中依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,加硅胶（100-200目）层析,收集洗脱流份,提取毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱（1:0.8）组成成分。用浓度为3.13μg/mL,6.25μg/mL和12.50μg/mL的毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱（1:0.8）处理SK-N-SH细胞22小时,同时用正常对照和0.1%DMSO药物溶剂对照。流式细胞仪检测药物毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱对细胞周期的影响,细胞活力分析仪Beckman coulter Vi-CELL进行活力细胞计数。实时定量PCR法检测毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱对SK-N-SH细胞APP基因mRNA的表达的影响。Western Blot法检测药物对SK-N-SH细胞IL-1β,c-Jun,c-Fos和APP蛋白表达的影响。EMSA检测APP基因启动子主要启动区（proximalpromoter region,PPR）以及激活蛋白-1（activator protein-1,AP-1）探针与SK-N-SH细胞核蛋白结合活性,研究药物对核蛋白结合活性的影响。结果:经流式细胞仪和细胞活力分析仪检测,实验浓度的毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱对SK-N-SH细胞的细胞周期和细胞活力无明显影响（P＞0.05）。经实时定量PCR和Western Blot检测,不同浓度的毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱（3.13μg/mL,6.25μg/mL和12.50μg/mL）均能显著减少SK-N-SH细胞APP基因mRNA的表达水平和蛋白表达的水平,其抑制作用随剂量增加而增加（P＜0.05）。然而,毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱不能影响SK-N-SH细胞IL-1β,c-Jun和c-Fos蛋白表达的水平（P＞0.05）。EMSA结果显示,毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱能显著抑制SK-N-SH细胞APP基因PPR区和AP-1探针与核蛋白的结合活性（P＜0.05）。结论:结果提示实验浓度的毕拨明宁碱/二氢毕拨明宁碱（3.13μg/mL,6.25μg/mL和12.50μg/mL）能有效负向调控SK-N-SH细胞AP-1探针和APP基因PPR区与核蛋白的结合活性。该药物有可能通过抑制APP启动子的蛋白结合活性来减少APP基因mRNA的表达和翻译,并且减少APP蛋白的表达。