论文部分内容阅读
硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS)属于糖胺聚糖(glycosaminoglycans, GAGs)家族,抗凝药物肝素(heparin, HP)为HS的特殊形式。HS广泛存在于哺乳动物的细胞表面和细胞外基质,通过与核心蛋白的丝氨酸／苏氨酸残基共价结合形成硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(Heparan sulfate proteoglycan, HSPG)微观结构高度不均一的HS可与大量不同的肝素结合蛋白(heparin binding proteins, HBPs)相互作用,参与或调节凝血、炎症反应、病原微生物感染、细胞增殖分化等诸多生物过程,因此,结构确定的HS寡糖是新型创新药物的重要先导化合物。由于HS结构的高度复杂性,化学法合成HS/HP寡糖面临反应步数多、合成效率低等挑战。美国北卡大学教堂山分校的刘建(Jian Liu)教授通过模拟HS/HP的生物合成过程发展了一种全新的化学酶法合成技术,被认为是当前高效合成多样化HS寡糖的理想策略。因此,本课题首先利用酶法制备得到了合成所必需的糖基供体尿苷二磷酸N-(三氟)乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc/TFA)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcAc)以及硫酸基供体腺苷3’-磷酸5’-磷酰硫酸(PAPS)；重点利用化学酶法合成了结构确定的不同HS骨架寡糖以及N-硫酸化、和6-O-硫酸化的HS寡糖；最后建立了HS寡糖的高效液相色谱-电雾式检测-质谱(HPLC-CAD-MS)联用分析方法。本论文取得的主要研究成果如下：1.糖基供体的酶法合成及规模化制备以N-乙酰氨基葡萄(GlcNAc)(或N-三氟乙酰氨基葡萄,GlcNTFA)为原料,经大肠杆菌表达的N-乙酰氨基葡萄1-激酶(NahK)、N-乙酰氨基葡萄尿苷转移酶(GlmU)和无机焦磷酸化酶(PPA)共同催化一步合成了UDP-GlcNAc或UDP-GlcNTFA;以尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)为原料,经牛肝UDP-Glc脱氢酶(UDP-Glc DH)和L-乳酸脱氢酶(LDH)双酶催化合成UDP-GlcA;用强阴离子交换柱层析纯化得到单一化合物,HPLC-多氨柱(PAMN)鉴定纯度>95%,三种糖基供体制备规模达到克级。2.硫酸基供体的酶法合成及规模化制备以三磷酸腺苷(ATP)及硫酸根离子为原料,在大肠杆菌共表达的ATP硫酸化酶-APS激酶(KAST-APSK)及PPA共同催化下一步合成PAPS;用强阴离子交换柱层析纯化得到PAPS, PAMN-HPLC鉴定纯度>90%,制备规模达到克级。3.HS骨架寡糖的酶法合成与结构表征以带UV标签的4-对硝基苯葡萄糖醛酸(GlcA-pnp)为起始原料,在N-乙酰氨基葡萄转移酶(KfiA)的催化下,以UDP-GlcNAc(或UDP-GlcNTFA)为糖基供体,向其非还端添加GlcNAc(或GlcNTFA),用PAMN-HPLC检测确定反应终点(产率>95%),用C18填料纯化得到二糖；然后在Pasteurella multocida heparosan合成酶PmHS2的催化下,以UDP-GlcA为糖基供体,向二糖非还端添加GlcA, PAMN-HPLC确定终点(产率>95%)并使用C18填料纯化得三糖；依次重复上述步骤,得到15种结构确定的不同HS骨架寡糖。ESI-MS及1HNMR验证了所得HS寡糖的结构。4.N-硫酸化的HS寡糖的化学酶法合成与结构表征以含三氟乙酰基(TFA)的HS三糖骨架为起始原料,用LiOH处理使GlcNTFA脱去TFA形成葡萄糖胺(GlcNH2),然后以PAPS为硫酸基供体,在N-硫酸基转移酶(NST)催化下对寡糖进行N-硫酸化(NS)修饰。以PAMN-HPLC确定终点(产率>95%)并使用强阴离子交换层析纯化,得到N-硫酸化的HS三糖(NS-3mer) 。 HPLC分析显示产物纯度大于99%,ESI-MS及1HNMR验证NS产物的结构。5.6-O-硫酸化的HS寡糖的酶法合成以上步NS-3mer为起始原料,以PAPS作为硫酸基供体,在6-O-硫酸基转移酶1和3(6-OST1/3)催化下对寡糖进行6-O-硫酸化(6S)修饰,PAMN-HPLC确定终点(产率>95%)并使用强阴离子交换层析纯化得到6-O-硫酸化的三糖(NS6S-3mer) 。 HPLC分析显示产物纯度大于99%,ESI-MS及1HNMR验证了6S产物的结构。类似地,以含TFA基团的HS骨架五糖、六糖为原料,依次重复上述NS及6S修饰过程,得到了NS修饰和NS6S修饰的HS五糖及六糖,HPLC鉴定纯度均大于95%,ESI-MS及1HNMR验证了产物的结构。6.HS骨架寡糖的HPLC-CAD/MS分析方法的建立针对HS寡糖在分离与鉴定中存在的困难,在HPLC-CAD体系下,分析不同色谱条件下HS骨架寡糖(二糖-八糖)在多孔石墨碳(PGC)色谱柱上的保留行为,首次以等度洗脱实现了七种寡糖的同时基线分离,最佳色谱条件为：流动相为乙腈/水/甲醇/三氟乙酸(48/48/4/0.2,v/v),流速为0.4 ml/min,温度25。C。将建立的分离方法直接移植到HPLC-MS体系中,实现7种HS寡糖的定性分析。