研究背景:癫痫是最常见的慢性神经系统性疾病,具有显著的发病率和死亡率。在中国,癫痫已经成为仅次于“偏头痛”的第二类神经系统性疾病。癫痫的一个临床特点是源于癫痫灶神经元的异常放电,进而传播到大脑的其它区域。针对癫痫起源的灶点和癫痫作用的机制,目前临床上对癫痫的治疗主要分为手术治疗和药物治疗。手术治疗相对彻底,但癫痫灶的位置难以固定并且波及范围广,给手术治疗带来一定的难度。所以目前对于癫痫的治疗多以药物治疗为主。目前临床上比较常用的抗癫痫药包括苯妥英钠、苯巴比妥、地西泮以及丙戊酸钠。抗癫痫药的作用机制分为两类,一类作用于突触以平衡神经元的兴奋和抑制,另一类作用在某些电压门控性的离子通道以降低神经元的兴奋性。但这些药物的作用机制主要靶向癫痫发作的症状,即缓解神经元兴奋与抑制的失衡而不能有效的作用在癫痫发作的根本原因。因此,三分之一的癫痫患者对于抗癫痫药物治疗产生了耐药性。所以,阐述癫痫发生的潜在机制有助于寻找和开发治疗癫痫的新的药物靶点,为更好的治疗癫痫提供新的思路。Cyclin-dependent kinase5（Cdk5）,属于细胞周期蛋白家族的一员。相比较于其它细胞周期蛋白家族,Cdk5的主要功能不在于其对细胞周期的调控。迄今为止,Cdk5在神经元中的功能研究的相对较多,在神经元中可以通过与其上游的p35/p39形成复合物,活化以后通过磷酸化下游的蛋白发挥相应的作用并参与到某些神经退行性疾病中,但是Cdk5在其它细胞类型中的研究相对较少。我们前期调研发现,内皮细胞中的Cdk5可以参与到某些生物学过程中,包括内皮细胞的迁移、增殖和芽生,但是这些生物学过程是否与某些神经系统性疾病相关我们并不清楚。由此,我们采用血管内皮细胞特异性敲除Cdk5的小鼠深入探究内皮细胞中Cdk5蛋白在癫痫中的功能,有望进一步认识血管系统在癫痫调控中的作用,这种调控作用的阐述可能为治疗癫痫的药物开发提供新的候选靶点。本课题的研究内容主要包含以下4个部分:1.血管内皮细胞特异性敲除Cdk5诱导自发性癫痫的产生目的:考察血管内皮细胞特异性Cdk5敲除后是否会导致某些神经系统性疾病的发生。这种神经系统性疾病是否与Cdk5敲除影响了小鼠的发育或者与外周血管系统Cdk5敲除有关。方法和结果:利用Cre-loxp系统,繁殖得到内皮细胞特异性敲除Cdk5的小鼠(Cdh5-Cre;Cdk5^f/f)。通过24小时的视频监控以及脑电图的记录发现,Cdh5-Cre;Cdk5^f/f小鼠在2月龄的时候即出现自发性癫痫（8.3%）,6月龄的敲除小鼠癫痫发作率达到了80%,但是1月龄的敲除小鼠没有明显的癫痫的发作。接下来,通过腹腔注射PTZ发现,1月龄的敲除小鼠PTZ诱导的癫痫易感性显著增加。进一步的,为了排除发育期的影响以及外周系统的影响,我们采用他莫昔芬诱导性敲除以及腺相关病毒（AAV-BR1-iCre）将Cre重组酶表达于1月龄Cdk5 floxed(Cdk5^f/f)小鼠的脑血管内皮细胞上,通过24小时的视频监控以及脑电图的记录发现脑微血管内皮细胞Cdk5缺失的小鼠同样出现自发性癫痫的表型。结论:血管内皮细胞中Cdk5的缺失,在2月龄或以上的敲除小鼠中会导致自发性癫痫的产生,癫痫灶主要起始于海马;无自发性癫痫的1月龄敲除小鼠对PTZ诱导的癫痫易感性增加。血管内皮细胞中Cdk5的缺失导致的自发性癫痫与发育期和外周血管系统Cdk5无关联性。2.Cdk5特异性敲除导致神经元的兴奋性以及星形胶质细胞的功能发生变化目的:以海马区锥体神经元为研究对象,考察神经元的活性以及胶质细胞的功能变化,即研究血管内皮细胞中Cdk5的特异性敲除是否会影响神经元的活性以及胶质细胞的功能。方法和结果:首先利用微透析技术检测敲除小鼠和对照小鼠中海马区谷氨酸的浓度。结果显示,特异性敲除内皮细胞中的Cdk5以后,1月龄和4月龄的敲除小鼠海马区谷氨酸的浓度均显著增高。电生理膜片钳技术分别考察海马区和皮层中锥体神经元的兴奋性,发现血管内皮细胞中Cdk5敲除后,海马区锥体神经元动作电位的发放频率以及兴奋性突触传递的频率均显著增加,但神经元的基本膜特性以及抑制性的突触传递不受影响,并且皮层中锥体神经元的兴奋性没有显著变化。药理学手段阻断兴奋性的突触后受体以后,发现敲除小鼠和对照小鼠的动作电位的发放频率趋于一致。上述结果提示敲除小鼠谷氨酸的浓度升高,通过作用于兴奋性的突触后受体,引起兴奋性的突触传递以及动作电位的发放频率增加,最终导致神经元的兴奋性增加以及癫痫的产生。利用免疫组化技术考察海马区和皮层中胶质细胞的形态变化,发现内皮细胞Cdk5敲除后,海马区星形胶质细胞数量和形态发生了明显的变化,1月龄的敲除小鼠即可引起星形胶质细胞产生明显的增生和激活,但皮层中的星形胶质细胞以及海马区的小胶质细胞的形态没有发生明显的改变。基于海马区星形胶质细胞的形态变化,利用电生理膜片钳技术记录1月龄Cdk5敲除小鼠海马区星形胶质细胞的功能。结果提示:血管内皮细胞敲除Cdk5以后,GLT1转运体介导的电流显著降低,GLAST转运体介导的电流无明显变化。进一步利用β-内酰胺类的抗生素头孢曲松特异性激活GLT1以及病毒注射的方法在海马区过表达GLT1,膜片钳记录发现GLT1激动剂能显著降低Cdk5敲除小鼠中锥体神经元放电频率、提高GLT1转运体介导的电流以及降低PTZ诱导的癫痫易感性。上述结果提示功能受损的GLT1通道介导的突触间隙谷氨酸浓度的增加是导致海马区锥体神经元兴奋性增加以及癫痫发生的根本原因。结论:血管内皮细胞特异性敲除Cdk5引起星形胶质细胞形态变化及谷氨酸转运体GLT1功能障碍,导致海马区谷氨酸浓度增加,最终使得锥体神经元兴奋性异常升高。采用药理学手段和病毒介导的过表达手段调控GLT1后,可以有效的降低锥体神经元的兴奋性以及癫痫表型。3.Cdk5缺失诱导CXCL1信号异常参与癫痫的病理机制及调控研究目的:探究血管内皮细胞特异性敲除Cdk5引起星形胶质细胞增生和激活介导癫痫发生的机制。方法与结果:利用伊文思蓝结合免疫荧光染色方法探究1月龄和4月龄敲除小鼠BBB的通透性。结果显示:1月龄敲除小鼠和对照小鼠之间BBB的通透性没有显著差异;4月龄的敲除小鼠呈现出伊文思蓝的渗透并且集中在活化的星形胶质细胞上。采用不同分子量的内源性和外源性示踪分子结合透射电镜以及免疫印迹实验进一步证实了1月龄Cdk5敲除小鼠BBB是相对完整的。利用1月龄对照小鼠和敲除小鼠的脑微血管内皮细胞原代培养结合转录组学进行分析。结果提示:Cdk5敲除小鼠的脑微血管内皮细胞大部分基因上调,并参与内皮细胞激活相关的信号通路,且炎性因子CXCL1的表达显著增加,但CXCL16的表达没有明显变化。利用实时定量PCR（qRT-PCR）以及酶联免疫吸附实验（ELISA）进一步证实了CXCL1转录水平以及蛋白水平的增加。脑片原位杂交实验亦证实CXCL1的增加主要位于微血管内皮细胞。随后在细胞水平,利用CXCL1的重组蛋白（20 ng）处理培养的原代星形胶质细胞(来自3周左右的Cdk5^f/f小鼠)6小时后,采用免疫荧光染色以及膜片钳技术检测,结果提示CXCL1重组蛋白增加星形胶质细胞的增生和激活,并且使GLT1转运体介导的功能发生紊乱。在动物整体水平上,我们在1月龄Cdh5-Cre;Cdk5^f/f和Cdk5^f/f小鼠海马脑区,采用套管给药给予CXCL1的中和抗体,或者一次性海马脑区注射AAV-BR1-shCXCL1病毒。上述处理后进行PTZ诱导的癫痫易感性的行为学分析和离体脑片的电生理记录。结果提示:不论是采用腺病毒特异性沉默内皮细胞中的CXCL1还是采用CXCL1的中和抗体给药,都可以显著降低1月龄敲除小鼠PTZ诱导的癫痫易感性,同时也显著降低星形胶质细胞的增生和激活、GLT1介导的谷氨酸转运体功能障碍以及神经元的兴奋性。结论:血管内皮细胞特异性Cdk5敲除对1月龄小鼠BBB通透性无影响,但是会引起内皮细胞分泌的CXCL1增加,进而引起星形胶质细胞的增生和激活、GLT1谷氨酸转运体电流下降。这一系列的变化与神经元的兴奋性以及癫痫的发生密切相关。4.基于CXCL1/CXCR2信号交互的GLT1功能障碍参与介导癫痫发作机制及调控研究目的:探究神经元和星形胶质细胞上CXCR2的功能。即研究内皮细胞分泌的CXCL1对神经元和星形胶质细胞的影响是否通过与其受体CXCR2的结合发挥作用。方法与结果:将依赖Cre重组酶的sh-CXCR2以及GFAP-Cre/CaMKIIα-Cre腺相关病毒,注射到1月龄的Cdh5-Cre;Cdk5^f/f和Cdk5^f/f小鼠的海马区,3周后进行行为学的考察以及免疫组化和电生理水平的验证。结果提示:特异性的沉默星形胶质细胞上的CXCR2,显著改善敲除小鼠PTZ诱导的癫痫易感性、星形胶质细胞的活化和GLT1介导的转运体功能障碍以及海马区锥体神经元的兴奋性的增加。但是特异性沉默锥体神经元上的CXCR2对以上的表型没有明显的改变。结论:靶向抑制星形胶质细胞CXCR2可降低Cdk5敲除小鼠神经元的兴奋性,显著改善PTZ诱导的癫痫易感性。