赤点石斑鱼MHC基因的克隆与多态性分析

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主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)是免疫系统中对蛋白抗原异物起反应的一类重要的免疫因子,广泛分布于各种脊椎动物体内。本研究以我国具有重要经济价值和养殖前景的赤点石斑鱼(Epinephelusakaara)为实验材料,采用PCR、RT-PCR、SMART-RACE、SSCP等技术对MHC家族MHCⅠA、MHCⅡA和MHCⅡB 3个基因进行克隆与多态性分析。主要结果如下:1.本研究首次成功克隆获得赤点石斑鱼的MHC classⅠα链,MHC classⅡα链及β链等3个重要的非特异性免疫因子的cDNA全序列,其中MHC classⅠα链全长1720bp,含3’UTR、启动子、多肽结合区(α1和α2)、免疫球蛋白样区(α3)、跨膜区、胞内区和5’UTR。MHC classⅡα链全长1870bp,含3’UTR、启动子、多肽结合区(α1)、免疫球蛋白样区(α2)、跨膜区、胞内区和5’UTR。MHC classⅡβ链全长1350bp,含3’UTR、启动子、多肽结合区(β1)、免疫球蛋白样区(β2)、跨膜区、胞内区和5’UTR。2.3个免疫蛋白因子均具有经典MHC蛋白分子的空间结构,在多肽结合区均存在极其丰富的变异。其中Ⅰα链的α1(1-90位)和α2(91-203位)分别由1个α螺旋和4个反向平行的β折叠组成,形成1个深沟状凹槽,α3(204-298位)主要由β折叠组成。Ⅱa链的α1(24~99位)由1个α螺旋和4个反向平行的β折叠组成,α2(100~200位)由多个β折叠组成。Ⅱβ链的β1(20~103位)1个α螺旋与4个反向平行的β折叠构成多肽结合区,β2(116~204位)由多个β折叠构成两个反向平行的三明治结构。3.3个非特异性免疫因子在脑、心、脾、肝、头肾、肠、肌肉、血细胞、胸腺、性腺,鳃,胃等12个组织均能有效表达,在头肾,脾,胸腺等免疫组织表达量不仅高,而且表达多态性也异常丰富。递呈内源性抗原的MHC classⅠ在与外界病原接触较多的鳃,肌肉,肠等组织表达较弱,而递呈外源性抗原的MHCclassⅡ在鳃,肌肉,肠等组织则有较强表达,体现了其表达与功能的适应性。4.建立了利用SSCP技术分离多肽MHC基因片段的方法,极大提高了MHC多态性基因的检测效率。本研究所获得的SSCP特异性引物及其建立的检测方法,将可为今后大量检测赤点石斑鱼多态性MHC序列,筛选可针对特定病原的特异序列提供有力的工具。5.根据3个分子的IGC区氨基酸序列构建了脊椎动物的系统进化树,其拓扑结构基本一致,不仅证实了硬骨鱼类的单系起源,而且支持了MHC系统分化早于原始鱼类向更高等脊椎动物进化的观点,同时也表明了3个分子的IGC区氨基酸序列可以作为研究鱼类物种间进化关系的良好标记。
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