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研究目的：
ClC-7(Voltage-gated chloride channel 7, ClC-7)是电压门控氯通道家族的重要成员，人ClC-7的编码基因(CLCN7)突变会导致骨硬化症。该病主要由破骨细胞功能障碍引起，临床特征为全身弥漫性骨密度增高、多发骨折。本项目对课题组前期已报道的两个CLCN7基因突变的骨硬化症家系进行临床分析，发现患者均出现不同程度的颅颌面骨发育异常、牙萌出异常、牙根发育不全。是否颅颌面骨及牙发育异常是CLCN7基因突变导致的骨硬化症患者伴发的特征性临床表现，ClC-7是否通过某些信号通路调节颅颌面骨和牙的发育，目前尚不清楚。基于以上问题，本课题从临床病例入手，通过基因敲降斑马鱼的体内研究及小鼠骨髓基质细胞(BMSCs)的体外研究，对ClC-7调控颅颌面骨及牙的发育机制进行了深入探讨，以期揭示骨硬化症的新致病机制，并为临床治疗该疾病提供新的参考方式。
研究方法：
第一部分CLCN7基因突变所致骨硬化症的临床研究
1、80例骨硬化症患者的回顾性研究：本研究对1965年以来文献报道的80例骨硬化症患者进行了回顾性研究，分析了这些患者的性别、年龄、分类及临床表现，重点关注这些患者的颅颌面骨和牙表型的变化。
2、骨硬化症的家系的研究：本部分选择了我科接诊的四个骨硬化症家系，进行了全面临床检查、基因分析和家系研究。临床检查中重点分析这些患者的颅颌面骨和牙表型变化。
第二部分clcn7基因敲降斑马鱼的体内研究
1、clcn7在斑马鱼胚胎发育早期的表达与分布：设计针对斑马鱼clcn7基因的实时定量引物和mRNA探针，收集不同发育时间点的斑马鱼胚胎(4cell、8cell、4hpf、7hpf、10hpf、1dpf、2dpf、3dpf、4dpf)，Q-PCR检测clcn7在斑马鱼中的表达量，原位杂交检测clcn7在斑马鱼中的表达定位。
2、clcn7参与调控斑马鱼颅颌面骨发育的研究：设计合成斑马鱼clcn7的Morpholino，显微注射斑马鱼胚胎，检测clcn7基因缺陷对斑马鱼发育的影响，主要包括：阿辛蓝/茜素红染色观察颅颌面骨的变化；原位杂交和Q-PCR检测clcn7基因敲降斑马鱼颅颌面部骨和软骨发育相关基因sp7，col10a1的表达变化。
3、clcn7参与调控斑马鱼牙发育的研究：阿辛蓝/茜素红染色观察clcn7基因敲降斑马鱼牙形态、数量和钙化的变化；体视显微镜下将第五腮弓连同咽齿剥离，扫描电镜下观察超微结构变化；原位杂交和Q-PCR检测clcn7基因敲降斑马鱼牙发育相关基因dlx2b，cx43，eve1，sp7的表达变化。
4、ClC-7调控颅颌面骨和牙发育的机制研究：溶酶体荧光探针LysoGreen染色检测溶酶体表达变化；Q-PCR及Westernblot检测组织蛋白酶K(CTSK)、TGF-β信号通路相关因子、BMP信号通路相关因子的表达变化；SB431542抑制TGF-β信号通路，检测对clcn7基因敲降斑马鱼表型的拯救效果。
第三部分Clcn7基因沉默小鼠骨髓基质细胞的系列体外研究
全骨髓贴壁分离法分离提取小鼠BMSCs，传代培养至第二代，转染Clcn7siRNA。Q-PCR及Westernblot检测Clcn7基因沉默前后细胞内TGF-β/BMP信号通路相关因子的表达变化。
研究结果：
第一部分CLCN7基因突变所致骨硬化症的临床研究
1、在统计的80例骨硬化症患者中84%的患者出现了典型的颅颌面骨和牙表型变化，包括大头畸形、额部隆起、面部骨骼的形状和比例发生变化、牙发育异常。进一步比较发现常染色体隐性骨硬化症患者发生颅颌面骨和牙异常的比例高于常染色体显性骨硬化症患者。
2、家系A患者CLCN7基因的第746位碱基由C突变为T(c.746C＞T，p.Pro249Leu，杂合突变)。家系B患者CLCN7基因的第856位碱基由C突变为T，同时第1430位碱基由T突变为C(c.856C＞T,p.Arg286Trp;c.1430T＞C,p.Leu477Pro，复合杂合突变)。四个骨硬化症家系均为CLCN7基因突变引起，并且患者伴发特定的颅颌面及牙表型变化，进一步比较发现IAO或严重的ADOII患者更容易出现颅颌面及牙发育异常。因此，CLCN7调控了骨硬化症的颅颌面发育模式。
第二部分clcn7基因敲降斑马鱼的体内研究
1、实时定量结果显示clcn7的mRNA在斑马鱼体内持续表达；原位杂交的结果表明，从1dpf开始，clcn7高表达在斑马鱼胚胎的头部，包括颅脑、眼睛、颌骨、腮弓等，3dpf后在斑马鱼的腮弓处强表达。
2、clcn7基因敲降斑马鱼表现为体长变短、头变小、颌骨畸形。通过阿辛蓝/茜素红染色发现颅颌面部舌骨小角夹角变大甚至反转。clcn7基因缺陷组斑马鱼的阿辛蓝/茜素红染色着色变浅。原位杂交及Q-PCR结果显示特征分子sp7和col10a1在颅颌面的表达均下降。因此，clcn7调控了斑马鱼的颅颌面发育模式。
3、clcn7基因敲降斑马鱼出现牙发育异常表现为牙的数量、形态和钙化发生改变，即clcn7基因缺陷斑马鱼中70%的斑马鱼有4V1，但只有30%的斑马鱼有3V1和5V1。经阿辛蓝/茜素红染色可见牙畸形，牙钙化程度降低。扫描电镜下可见牙畸形、牙表面粗糙、多孔。原位杂交结果显示在clcn7基因敲降组dlx2b、cx43、eve1、sp7的表达均下降。因此，clcn7对斑马鱼牙的发育及矿化至关重要。
4、clcn7基因敲降斑马鱼出现溶酶体蓄积，CTSK的表达下降，TGF-β下游Smad2的活性增强，BMP下游Smad1/5/8的活性减弱，进而打破了TGF-β与BMP信号通路的平衡，引起了颅颌面骨和牙的发育异常。TGF-β信号通路抑制剂SB431542，可有效拯救clcn7基因敲降斑马鱼出现的颅颌面骨和牙的表型变化。因此，ClC-7通过溶酶体，CTSK和下游TGF-β/BMP信号通路调节颅颌面骨和牙的发育。
第三部分Clcn7基因沉默小鼠骨髓基质细胞的系列体外研究
在小鼠BMSCs中沉默Clcn7，Q-PCR结果显示Ctsk、Bmp2、Bmpr1a、Bmpr1b、Smad1表达水平下降。Westernblot结果显示pSMAD2水平升高，pSMAD1/5/8的水平下降。体外实验与体内实验结果一致，Clcn7表达下调同样引起了TGF-β与BMP信号通路的失衡。
结论：
1、本研究明确了骨硬化症具有特异的颅颌面和牙表型，ClC-7调控了颅颌面的发育模式。
2、ClC-7/CTSK/TGF-β/BMP/SMAD机制链参与一些遗传性骨病如骨硬化症、致密性成骨不全患者出现的颅颌面骨和牙发育异常的发生。
3、TGF-β信号通路的抑制剂可以拯救clcn7缺陷斑马鱼的颅颌面骨和牙表型，该发现为伴发颅颌面骨发育异常的系列遗传性骨病的防治提供了新的视角。
ClC-7(Voltage-gated chloride channel 7, ClC-7)是电压门控氯通道家族的重要成员，人ClC-7的编码基因(CLCN7)突变会导致骨硬化症。该病主要由破骨细胞功能障碍引起，临床特征为全身弥漫性骨密度增高、多发骨折。本项目对课题组前期已报道的两个CLCN7基因突变的骨硬化症家系进行临床分析，发现患者均出现不同程度的颅颌面骨发育异常、牙萌出异常、牙根发育不全。是否颅颌面骨及牙发育异常是CLCN7基因突变导致的骨硬化症患者伴发的特征性临床表现，ClC-7是否通过某些信号通路调节颅颌面骨和牙的发育，目前尚不清楚。基于以上问题，本课题从临床病例入手，通过基因敲降斑马鱼的体内研究及小鼠骨髓基质细胞(BMSCs)的体外研究，对ClC-7调控颅颌面骨及牙的发育机制进行了深入探讨，以期揭示骨硬化症的新致病机制，并为临床治疗该疾病提供新的参考方式。
研究方法：
第一部分CLCN7基因突变所致骨硬化症的临床研究
1、80例骨硬化症患者的回顾性研究：本研究对1965年以来文献报道的80例骨硬化症患者进行了回顾性研究，分析了这些患者的性别、年龄、分类及临床表现，重点关注这些患者的颅颌面骨和牙表型的变化。
2、骨硬化症的家系的研究：本部分选择了我科接诊的四个骨硬化症家系，进行了全面临床检查、基因分析和家系研究。临床检查中重点分析这些患者的颅颌面骨和牙表型变化。
第二部分clcn7基因敲降斑马鱼的体内研究
1、clcn7在斑马鱼胚胎发育早期的表达与分布：设计针对斑马鱼clcn7基因的实时定量引物和mRNA探针，收集不同发育时间点的斑马鱼胚胎(4cell、8cell、4hpf、7hpf、10hpf、1dpf、2dpf、3dpf、4dpf)，Q-PCR检测clcn7在斑马鱼中的表达量，原位杂交检测clcn7在斑马鱼中的表达定位。
2、clcn7参与调控斑马鱼颅颌面骨发育的研究：设计合成斑马鱼clcn7的Morpholino，显微注射斑马鱼胚胎，检测clcn7基因缺陷对斑马鱼发育的影响，主要包括：阿辛蓝/茜素红染色观察颅颌面骨的变化；原位杂交和Q-PCR检测clcn7基因敲降斑马鱼颅颌面部骨和软骨发育相关基因sp7，col10a1的表达变化。
3、clcn7参与调控斑马鱼牙发育的研究：阿辛蓝/茜素红染色观察clcn7基因敲降斑马鱼牙形态、数量和钙化的变化；体视显微镜下将第五腮弓连同咽齿剥离，扫描电镜下观察超微结构变化；原位杂交和Q-PCR检测clcn7基因敲降斑马鱼牙发育相关基因dlx2b，cx43，eve1，sp7的表达变化。
4、ClC-7调控颅颌面骨和牙发育的机制研究：溶酶体荧光探针LysoGreen染色检测溶酶体表达变化；Q-PCR及Westernblot检测组织蛋白酶K(CTSK)、TGF-β信号通路相关因子、BMP信号通路相关因子的表达变化；SB431542抑制TGF-β信号通路，检测对clcn7基因敲降斑马鱼表型的拯救效果。
第三部分Clcn7基因沉默小鼠骨髓基质细胞的系列体外研究
全骨髓贴壁分离法分离提取小鼠BMSCs，传代培养至第二代，转染Clcn7siRNA。Q-PCR及Westernblot检测Clcn7基因沉默前后细胞内TGF-β/BMP信号通路相关因子的表达变化。
研究结果：
第一部分CLCN7基因突变所致骨硬化症的临床研究
1、在统计的80例骨硬化症患者中84%的患者出现了典型的颅颌面骨和牙表型变化，包括大头畸形、额部隆起、面部骨骼的形状和比例发生变化、牙发育异常。进一步比较发现常染色体隐性骨硬化症患者发生颅颌面骨和牙异常的比例高于常染色体显性骨硬化症患者。
2、家系A患者CLCN7基因的第746位碱基由C突变为T(c.746C＞T，p.Pro249Leu，杂合突变)。家系B患者CLCN7基因的第856位碱基由C突变为T，同时第1430位碱基由T突变为C(c.856C＞T,p.Arg286Trp;c.1430T＞C,p.Leu477Pro，复合杂合突变)。四个骨硬化症家系均为CLCN7基因突变引起，并且患者伴发特定的颅颌面及牙表型变化，进一步比较发现IAO或严重的ADOII患者更容易出现颅颌面及牙发育异常。因此，CLCN7调控了骨硬化症的颅颌面发育模式。
第二部分clcn7基因敲降斑马鱼的体内研究
1、实时定量结果显示clcn7的mRNA在斑马鱼体内持续表达；原位杂交的结果表明，从1dpf开始，clcn7高表达在斑马鱼胚胎的头部，包括颅脑、眼睛、颌骨、腮弓等，3dpf后在斑马鱼的腮弓处强表达。
2、clcn7基因敲降斑马鱼表现为体长变短、头变小、颌骨畸形。通过阿辛蓝/茜素红染色发现颅颌面部舌骨小角夹角变大甚至反转。clcn7基因缺陷组斑马鱼的阿辛蓝/茜素红染色着色变浅。原位杂交及Q-PCR结果显示特征分子sp7和col10a1在颅颌面的表达均下降。因此，clcn7调控了斑马鱼的颅颌面发育模式。
3、clcn7基因敲降斑马鱼出现牙发育异常表现为牙的数量、形态和钙化发生改变，即clcn7基因缺陷斑马鱼中70%的斑马鱼有4V1，但只有30%的斑马鱼有3V1和5V1。经阿辛蓝/茜素红染色可见牙畸形，牙钙化程度降低。扫描电镜下可见牙畸形、牙表面粗糙、多孔。原位杂交结果显示在clcn7基因敲降组dlx2b、cx43、eve1、sp7的表达均下降。因此，clcn7对斑马鱼牙的发育及矿化至关重要。
4、clcn7基因敲降斑马鱼出现溶酶体蓄积，CTSK的表达下降，TGF-β下游Smad2的活性增强，BMP下游Smad1/5/8的活性减弱，进而打破了TGF-β与BMP信号通路的平衡，引起了颅颌面骨和牙的发育异常。TGF-β信号通路抑制剂SB431542，可有效拯救clcn7基因敲降斑马鱼出现的颅颌面骨和牙的表型变化。因此，ClC-7通过溶酶体，CTSK和下游TGF-β/BMP信号通路调节颅颌面骨和牙的发育。
第三部分Clcn7基因沉默小鼠骨髓基质细胞的系列体外研究
在小鼠BMSCs中沉默Clcn7，Q-PCR结果显示Ctsk、Bmp2、Bmpr1a、Bmpr1b、Smad1表达水平下降。Westernblot结果显示pSMAD2水平升高，pSMAD1/5/8的水平下降。体外实验与体内实验结果一致，Clcn7表达下调同样引起了TGF-β与BMP信号通路的失衡。
结论：
1、本研究明确了骨硬化症具有特异的颅颌面和牙表型，ClC-7调控了颅颌面的发育模式。
2、ClC-7/CTSK/TGF-β/BMP/SMAD机制链参与一些遗传性骨病如骨硬化症、致密性成骨不全患者出现的颅颌面骨和牙发育异常的发生。
3、TGF-β信号通路的抑制剂可以拯救clcn7缺陷斑马鱼的颅颌面骨和牙表型，该发现为伴发颅颌面骨发育异常的系列遗传性骨病的防治提供了新的视角。