第一部分载甲氨蝶呤可溶性微针贴片的制备和基本性能表征背景:甲氨蝶呤（MTX）是治疗中重度银屑病的一线药物之一,然而系统给药引起的许多副作用明显限制其临床应用。与传统给药途径相比,经皮药物递送具有许多优势,但目前的透皮促渗技术尚未达到理想效果。载药可溶性微针贴片在扎入皮肤溶解的同时释放药物,这对银屑病患者来说可能是一种更佳的MTX给药方式。目的:制备载MTX可溶性微针贴片,并对其各项基本性能进行初步检测。方法:采用两步微成型工艺制备不同药物含量的载MTX可溶性微针贴片,皮肤镜观察其外观形貌特征,紫外分光光度法检测其载药量,纳米压痕仪测定其机械强度,激光扫描共聚焦显微镜观察其体外透皮渗透,透皮扩散池检测其体外透皮药物释放,光学显微镜和扫描电子显微镜观察微针扎入体内后的溶解情况,咪喹莫特（IMQ）诱导银屑病样皮损并观察微针扎入皮肤后的组织切片以评价其穿透增厚表皮的能力,皮肤镜持续记录微针扎入后的皮肤外观表现以测试其刺激性,CCK-8法检测载药微针对人永生化角质形成细胞（Ha Ca T细胞）增殖的影响以评估所载MTX的体外药物活性。结果:制备得到的每个载MTX可溶性微针贴片由基底以及100个（10×10）呈金字塔状的针体组成,微针针体的高度为650±19μm,基底直径为220±7μm,针间距为500±12μm。由含MTX浓度为6.25、12.5、25和50 mg/m L的溶液制备得到的载MTX可溶性微针贴片所含药物量分别为6.5±1.3、13.8±1.8、30.6±2.3和65.3±2.9μg。随着载药量的提高,其机械强度逐渐下降。载罗丹明6G的可溶性微针贴片扎入新鲜离体猪皮后染料的扩散深度大于150μm。载MTX微针贴片的体外透皮累积释放百分比在10 min达52%,在1.5 h释放约90%后几乎不再发生变化。载MTX微针贴片能穿透增厚的表皮并在扎入皮肤10 min内完全溶解。微针扎入皮肤处在观察期间没有发生明显的刺激性反应（例如红斑、肿胀等）,在1 h后肉眼几乎无法观察到扎入的痕迹。载MTX微针贴片与MTX溶液对Ha Ca T细胞增殖水平的抑制无明显差异（p>0.05）。结论:我们制备的载MTX可溶性微针贴片具备良好的水溶性、生物相容性、生物降解性、机械强度和载药量可控性。该微针贴片有效穿透IMQ诱导的增厚表皮后快速溶解并释放药物。同时,MTX的药物活性在微针贴片的制作中几乎没有损失。第二部分不同载药量的载甲氨蝶呤可溶性微针贴片治疗咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损的效应研究背景:近年来有研究发现实心固体微针在体外实验中能够促进MTX的透皮,不过这些微针仅仅只是用来在涂抹外用药物制剂之前预先在皮肤表面形成微孔道。由于微针揭除后微孔道会逐渐闭合,药物的经皮吸收就会被限制,导致疗效降低。因此,体内效应的探究具有十分重要的意义。在第一部分中,我们制备了不同载药量的载MTX可溶性微针贴片并通过体外实验证实其有效的透皮促渗作用。在这一部分,我们进一步研究载MTX可溶性微针贴片对IMQ诱导的小鼠银屑病样皮肤炎症的效应。目的:探究不同载药量的载MTX可溶性微针贴片对IMQ诱导的银屑病样皮损的体内疗效和系统作用。方法:BALB/c小鼠被随机分为6组（每组5只）,其中不做任何处理的一组作为正常对照组,其他小鼠均连续6天（第1~6天）在左耳涂抹IMQ乳膏,并分为以下5个不同处理组（第2~6天进行处理）:（1）疾病模型组（只造模,无处理）,（2）纯HA微针组（未载药的微针贴片处理）,（3）低剂量载MTX微针组（载药量约6.5μg/片）,（4）中剂量载MTX微针组（载药量约13.8μg/片）,（5）高剂量载MTX微针组（载药量约30.6μg/片）。每只小鼠的微针贴片治疗量均为1片/天。记录小鼠耳部肿胀厚度变化以反映皮肤炎症的严重程度。第7天每只小鼠左耳的皮肤组织石蜡切片分别进行HE染色以及Ki67、IL-23和IL-17A的IHC染色分析。此外,对小鼠的血细胞进行计数并检测血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）和血肌酐（CREA）的含量。结果:涂抹IMQ使小鼠耳部皮肤出现的典型表现包括红斑、增厚和脱屑。载MTX可溶性微针贴片治疗的小鼠皮损部位则呈现不同程度的炎症缓解,尤其是中剂量和高剂量组。但纯HA微针组小鼠的皮肤病变程度与疾病模型组几乎一致。低、中、高剂量的载MTX可溶性微针贴片治疗后,小鼠耳部厚度由500.8±29.8μm分别降至421.8±28.7（p<0.01）、339.6±23.2（p<0.001）和269.2±21.1μm（p<0.001）,同时表皮厚度从108.1±9.4μm被分别抑制到90.3±9.0（p<0.05）、62.3±8.9（p<0.001）和34.6±6.6μm（p0.05）。IMQ使小鼠血液中的WBC数量（p<0.001）和中性粒细胞数量（p0.05）,但是高剂量载MTX可溶性微针贴片使小鼠血液中的WBC数量（p<0.001）和中性粒细胞数量（p0.05）。结论:载MTX可溶性微针贴片能够缓解IMQ诱导的银屑病样皮炎,皮损的改善程度与微针的载药量呈正相关。这一部分研究中所用到的载MTX微针贴片对小鼠的肝肾功能均未造成明显影响,但高剂量组抑制了IMQ致敏的免疫系统和造血系统。第三部分载甲氨蝶呤可溶性微针贴片与口服甲氨蝶呤治疗咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损的疗效和安全性比较研究背景:口服给药是MTX在银屑病治疗中最常见的应用方式,但由于药物容易在胃肠道内被部分降解、还会被肝脏部分清除,药物的疗效因此受限,并且对消化系统产生副作用。载MTX可溶性微针贴片扎入皮肤后快速溶解,同时直接将药物递送至皮损,提高了生物利用度,有望改善疗效并降低系统毒性。因此,我们对载MTX微针贴片以及口服MTX的体内疗效和安全性进行了比较研究。目的:比较载MTX微针贴片与口服MTX治疗IMQ诱导的小鼠银屑病样皮损的疗效、系统影响和毒性。方法:BALB/c被随机分为5组。除正常对照组外,其他4组小鼠均在左耳涂抹IMQ乳膏建立银屑病样皮损模型。载MTX微针组中,每只小鼠的微针贴片治疗量均为1片/天（载药量约13.8μg/片）,于第2~6天进行处理。为了与口服给药进行比较,MTX口服组和2倍剂量MTX口服组小鼠分别每天灌胃一次给予13.8μg和27.6μg的MTX。皮肤炎症的严重程度采用耳部厚度表示,第7天观察小鼠左耳的皮损情况。皮肤组织的石蜡切片均进行HE染色和Ki67的IHC染色分析。检测小鼠血细胞计数以及ALT、AST、BUN和CREA的血清水平以反映载MTX可溶性微针贴片与口服MTX的系统影响和肝肾毒性。结果:在接受不同方式的MTX治疗后,IMQ导致的皮肤红斑、增厚和脱屑出现不同程度减轻。与MTX口服组相比,使用含相同药物剂量（约13.8μg）的载MTX微针贴片和2倍剂量（27.6μg）MTX口服治疗后,第7天观察可见小鼠左耳皮损的典型银屑病样表现均得到更明显的缓解。当给药量（13.8μg）相同时,载MTX微针贴片对耳部增厚（p<0.01）、表皮增生（p<0.01）和Ki67表达水平（p0.05）。此外,在所有治疗组中,只有27.6μg口服MTX处理的小鼠WBC数量（p<0.001）、中性粒细胞数（p<0.01）和淋巴细胞数量（p<0.05）显著降低,同时ALT（p<0.001）和AST（p<0.05）的血清含量也明显升高。结论:载MTX可溶性微针贴片对IMQ诱导的小鼠银屑病样皮损的治疗效果优于口服给药,并且能以明显更低的剂量达到与口服给药相似的疗效,因此减少系统影响和肝毒性等。第四部分载甲氨蝶呤可溶性微针贴片对咪喹莫特诱导的远处二次银屑病样皮损形成的作用研究背景:银屑病是一种慢性复发性炎症性皮肤病。已有研究表明银屑病样皮损的引流淋巴结（d LNs）中的IL-17A+Vγ4+γδT“记忆样”细胞可以迁移至皮肤炎症发生原处,也可以迁移至机体的其他部位并长期存在。因此,如果受到IMQ的再次刺激,将会出现比首次更快、更强的银屑病样皮肤炎症。在前面几个部分中,我们已经证实了载MTX微针贴片比口服给药更高效且更安全。那么,进一步探究载MTX微针贴片是否能够在缓解原位皮肤炎症的同时对银屑病的复发也产生抑制作用并且揭示相关治疗机制具有重要的实际意义。目的:探究载MTX微针贴片治疗原位皮损对IMQ再次诱导远处二次皮损形成的效应以及可能的相关机制。方法:在这一部分中,我们实施了2项动物实验。第一项实验中,小鼠分为正常对照组、疾病模型组和载MTX微针组以研究载MTX微针贴片对IMQ诱导的小鼠银屑病样皮损及其d LNs中IL-17A+Vγ4+γδT细胞的影响。小鼠在第1至5天接受IMQ涂抹和载MTX微针贴片治疗,第6天对小鼠左耳的真皮以及d LNs进行流式细胞术检测。在另一项实验中,小鼠被随机分4组,并按照第1至5天对左耳的不同处理方式分为:正常对照组,IMQ组,IMQ+载MTX微针组和载MTX微针组。随后5天的间隔期（第6至10天）不进行任何处理,从第11天起,在每只小鼠的右耳连续4天（第11至14天）涂抹IMQ,记录第11至15天小鼠右耳的厚度以反映炎症水平,第15天右耳的皮肤组织石蜡切片分别进行HE染色和Ki67的IHC染色分析,并对右耳真皮中的IL-17A+Vγ4+γδT细胞进行流式细胞术检测。结果:第一项实验中,与未治疗的疾病模型组相比,载MTX可溶性微针贴片使左耳皮损真皮（p<0.001）和d LNs（p<0.001）中的IL-17A+Vγ4+γδT细胞的数量均显著减少。在另一项实验中,第1至5天载MTX微针贴片对IMQ诱导的小鼠左耳银屑病样皮损的治疗能够明显抑制第11至14天小鼠右耳再次诱导银屑病样皮损的形成。具体而言,与IMQ组相比,IMQ+载MTX微针组小鼠右耳的肿胀增厚（p<0.001）、表皮增生（p<0.05）和Ki67表达水平（p<0.01）都被显著抑制。更重要的是,小鼠右耳皮肤真皮中的IL-17A+Vγ4+γδT细胞的数量也明显减少（p<0.001）。但IMQ+载MTX微针组和载MTX微针组之间各项检测指标的差异均无统计学意义。结论:载MTX可溶性微针贴片不仅能直接缓解IMQ诱导的局部银屑病样皮肤炎症,它还可以通过减少微针作用部位皮肤及其d LNs中的IL-17A+Vγ4+γδT细胞抑制远处部位IMQ再次刺激诱导的皮肤炎症。