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猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由绪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪的一种急性、高度接触性肠道传染病,临床上以腹泻、呕吐、脱水为主要特征。PEDV表面的纤突蛋白(S蛋白)是病毒的主要结构蛋白之一,在病毒侵入宿主和诱导机体产生中和抗体的过程中起到重要作用。国内外PEDV S基因的遗传进化分析显示,相比于经典毒株(CV777),近年的流行毒株S基因5’端发生了明显的插入和缺失。本研究针对PEDV经典株和流行株开展S蛋白N段片段免疫反应性差异研究,以期为PEDV的遗传变异分析、鉴别诊断及免疫保护机制研究提供参考依据。选取PEDV经典株CV777和流行株NB2011株S基因5’端差异较大的区段(CV777-S661,NB-S673)进行 RT-PCR 扩增,克隆至 pET-28a 载体并转化E.coli BL21菌株进行表达,分别获得S661和S673重组蛋白。Western blotting结果表明S661和S673表达蛋白均能与猪PEDV阳性血清发生特异性反应,且不与猪PEDV阴性血清反应。说明表达蛋白具有免疫反应性。以纯化的重组蛋白为免疫原制备鼠多抗血清,对两种重组蛋白进行交叉Dot-ELISA试验。结果显示抗S661多抗血清对S661和S673蛋白的可见反应最低蛋白浓度分别为31.25μg/ml和125μg/ml,抗S673多抗血清对二种蛋白的可见反应最低蛋白浓度均为62.5μg/ml。分别制备了抗S673和抗S661的单克隆抗体,共获得4株分泌抗S673单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1D7、2E11、3G9、4G5;2株分泌抗S661单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4A12、5G8。抗体亚型鉴定结果表明,3G9、5G8和4A12为IgGl型,1D7和2E11为IgG2a型,4G5为IgG2b型。抗体叠加ELISA试验表明,1D7、2E11、3G9、4G5所识别的抗原位点相同或相似,4A12、5G8所识别的抗原位点也没有差异。交叉Western-blot结果表明,抗S673和抗S661的单克隆抗体均能与相应重组蛋白发生特异性反应,且不与另一毒株蛋白发生反应。IFA结果显示,抗S673和S661的单克隆抗体均能与CV777感染的Vero细胞产生特异性免疫荧光。以上结果说明,PEDV经典株和流行株S蛋白N端片段存抗原性差异。