胰蛋白酶作为一种重要的工具酶,已经被广泛应用于工业和科研等领域。通常情况下,胰蛋白酶酶切其他蛋白的反应温度为20-40°C,而工业或科研领域中多数反应需要在高温下进行。胰蛋白酶在高温环境中不能保持很高的活性,这极大地限制了其在工业上的应用。近年来,应用蛋白质工程手段改造酶的热稳定性已经成为一个有效的方法。因此,为了提高胰蛋白酶的工业应用价值,可以借助蛋白质工程的手段来提高胰蛋白酶的热稳定性。本研究基于理性设计的策略,尝试利用截短柔性区域的方法提高胰蛋白酶的热稳定性。首先综合比较了分子动力学模拟、Fold Unfold和Flex Pred三种方法的预测结果,确定Fragment 78-90为胰蛋白酶的高柔性区域。其次,通过截短柔性区域的方法对蛋白质进行刚化,基于不影响活性位点的原则设计了5株突变体（D3、D5、D7、D9及D11）,并利用重叠延伸PCR的方法对胰蛋白酶的柔性区域进行截短。之后转入毕赤酵母GS115中进行高效表达纯化,最终得到野生型胰蛋白酶的产率为43.32 mg/L,五个突变型胰蛋白酶（D3、D5、D7、D9和D11）的产率分别为25.82 mg/L,29.92 mg/L,53.44 mg/L,40.58 mg/L和33.49 mg/L。对野生型和突变型胰蛋白酶的热稳定性、比活、动力学参数、二级结构、三级结构进行测定,发现突变型D9的热稳定性提高了。与野生型胰蛋白酶相比,其T_m值提高了4.5°C,T_opt提高了5°C,T₅₀¹⁰提高了5.8°C,半衰期提高了46 min。同时,突变型D9的比活及催化效率(k_cat/K_m)没有降低,CD光谱和荧光光谱也显示突变型D9的二、三级结构没有发生明显的改变。此外,胰蛋白酶表面疏水性的测定结果表明,突变型D9的疏水性降低,疏水作用增强,这可能对突变型D9热稳定性提高有积极的影响。本研究通过截短柔性区域的方法,在不影响酶活的情况下,提高了胰蛋白酶的热稳定性,这对工业上其他工具酶的热稳定性改造有借鉴意义。