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【研究背景】乳腺癌发病率死亡率都较高,是女性最常见的恶性肿瘤之一。乳腺癌具有高度的异质性,临床上乳腺癌依据细胞表面分子标记物特征可分为多种亚型。其中雌激素受体(ER)孕激素受体(PR)人表皮生长因子受体2(HER-2)均阴性表达的称为三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)。TNBC是各类亚型乳腺癌中的凶险之最。化疗是其首选的治疗方法,但是,TNBC缺乏明确治疗靶点,临床指南多推荐使用细胞毒性药物如表柔比星(Epirubicin)或者紫杉醇(Paclitaxel)进行治疗,不良反应多,副作用大而治疗却效果不尽人意,主要原因是获得性耐药的发生导致肿瘤的二次复发或转移。TNBC相对于其他各亚型有较高比例的肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs),这是肿瘤组织中存在的一小部分具有自我更新多向分化侵袭转移等干细胞特性的细胞,文献报道CSCs在多种肿瘤中都与化疗耐药有关。乳腺癌中一般CD44~+/CD24~-ALDH~+的被认为是乳腺癌干细胞(BCSCs)。许多文献相继报道,化疗药物刺激后,大部分细胞死亡,残存的肿瘤细胞出现表型变化,最常见的变化包括上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和肿瘤干细胞样“干性”表型(Stemness phenotype)转化,肿瘤干细胞是导致多种肿瘤化疗耐药的关键因素之一。而这一过程涉及多种信号通路的变化,其中TGF-β信号传导通路备受关注:TGF-β是一种多功能细胞因子,其可通过经典的Smad依赖或者非Smad依赖的途径激活下游信号通路,在组织与器官的发生,免疫反应等生物过程中有着重要的角色。近年来,TGF-β信号通路被发现在BCSCs的自我更新和分化中起到重要调控作用,但它在TNBC化疗耐药中的精确分子调控机制目前仍不清楚。我们在课题组前期的研究中发现一种转录因子Runx2可能与这一过程相关。核心结合因子Runx2,高表达于骨组织和乳腺组织,是一种在骨组织发育分化和多种肿瘤发生发展中高度活跃的分子,尤其是在乳腺癌骨转移的过程。前期的实验结果发现,Runx2在三阴性乳腺癌细胞系以及组织中高表达,并且高表达与病人的不良预后相关。在高表达Runx2的MB-231细胞中敲低Runx2的表达,CD44~+/CD24~-的BCSC比例下降;而在低表达Runx2的MCF-7细胞中抬高Runx2的表达,则CD44~+/CD24~-的BCSCs比例上升,免疫印迹的结果相一致。这说明了Runx2可以调控BCSCs。猜测其可能在TNBC化疗耐药的发生过程中通过调控BCSCs起到一定作用。【研究目的】在前期研究工作的基础上,观察化疗药物表柔比星的刺激是否导致了三阴性乳腺癌中TGF-β,Runx2以及干细胞标志物的表达上调;其上调是否和乳腺癌化疗耐药有关;Runx2是否可以通过调控TGF-β的表达促进EMT来调控乳腺癌干细胞的比例参与三阴性乳腺癌的化疗耐药;Runx2是否有其他的耐药调控机制以及TGF-β是否也对Runx2有所作用。这些耐药分子机制的探索为以Runx2-TGF-β为靶点逆转三阴性乳腺癌患者化疗耐药,提高病人生存率提供了理论基础。【研究内容】1.用三阴性乳腺癌临床化疗常用药物表柔比星(Epi)急性处理三阴性乳腺癌细胞系MB-231以及SUM-149,观察Runx2,TGF-β,干细胞标志物的表达变化。明确表柔比星在三阴性乳腺癌化疗中对Runx2,TGF-β和乳腺癌干细胞的上调和活化作用。2.用慢性低浓度表柔比星逐渐加量法诱导6-12个月建立稳定耐药的TNBC细胞系MB-231/Epi。MTT药物毒性实验,平板克隆及其耐药性实验检测耐药细胞的耐药性,计算耐药指数RI;MTT增殖实验,Transwell,流式细胞术,微球体形成实验等检测耐药细胞与亲本细胞的表型差异;Western Blot检测TGF-β,BCSC Marker和TGF-β所调控的蛋白分子的表达;免疫组化检测TNBC与非TNBC病人的病理切片,用Kaplan-Meier绘制TNBC病人化疗后TGF-β高低表达的生存曲线。得出TNBC耐药细胞的相关特性和TGF-β在TNBC化疗耐药中的作用。3.用慢病毒感染敲低抬高靶基因的方法,敲低耐药细胞的Runx2表达,抬高普通细胞SUM-149中Runx2的表达,嘌呤霉素药筛出稳转株。MTT药物毒性实验检测它们的耐药性,Western Blot检测TGF-β以及EMT,干细胞标志物的表达,流式细胞术以及干细胞微球体形成实验检测干性。Transwell实验检测EMT相关的迁移侵袭能力。得出Runx2对化疗耐药以及干性,TGF-β信号活化的调控作用。4.Western Blot以及RT-PCR检测耐药机制相关标志物如TGF-β,p-Smad2/3,MDR1,BCRP,P53等的表达变化,探索Runx2调控TNBC耐药性的确切分子机制。5.用TGF-β细胞因子梯度剂量诱导MB-231细胞不同时间,探究TGF-β对Runx2表达的调控作用以及对化疗耐药的影响。【研究结果】1.急性表柔比星刺激后,Western Blot显示TNBC细胞MB-231的TGF-β,BCSCs标志物CD44~+/CD24~-和Runx2的表达呈一定剂量依赖性上升趋势。2.通过表柔比星慢性诱导8个月建立了TNBC表柔比星耐药细胞系MB-231/Epi;慢病毒感染建立了敲低Runx2表达的Epi-Runx2i(Epi-KD)以及其阴性对照细胞系Epi-NC;建立了抬高Runx2表达的三阴性乳腺癌细胞系SUM-Runx2(SUM-OE)以及其阴性对照细胞系SUM-NC。3.免疫印迹结果显示MB-231/Epi细胞Runx2,TGF-β与BCSCs标志物表达上升。MTT药物毒性实验,平板克隆及其耐药性实验,MTT增殖实验,Transwell实验,流式细胞术,微球体形成等实验结果显示耐药细胞耐药性增强,RI是亲本的6.747倍,增殖减缓,EMT相关迁移与侵袭能力增强,BCSCs“干性”增强。4.Western Blot,MTT药物毒性实验,平板克隆及其耐药性实验,Transwell实验,流式细胞术,微球体形成等实验结果显示在TNBC耐药细胞中敲低Runx2表达可逆转耐药细胞耐药性,“干性”,TGF-β的表达,EMT相关侵袭迁移能力以及相应分子标志物。而在非耐药的三阴性乳腺癌细胞系SUM-149中抬高Runx2的表达则有着相反的变化。5.RT-PCR与Western Blot检测TGF-β信号通路分子标志物以及耐药标志物如Hif-a,MDR1,BCRP,P53等的表达,结果显示敲低Runx2表达逆转TNBC的化疗耐药与Runx2可上调TGF-β的表达引起EMT的发生导致BCSCs比例增加以及对多耐药蛋白MDR1的表达调控有关。6.Western Blot检测TGF-β细胞因子梯度剂量不同时间诱导TNBC细胞的蛋白表达情况,发现TGF-β对Runx2表达存在反馈调控作用且TGF-β诱导Runx2的上调程度与其诱导的耐药程度正相关。【结论】1.表柔比星急性刺激和慢性诱导都会使TNBC细胞TGF-β,Runx2以及BCSC干细胞标志物表达上调,TGF-β在三阴性乳腺癌表柔比星化疗耐药中有着重要的调控作用。2.Runx2可以通过上调TGF-β的表达来促进EMT发生,进而引起CD44~+/CD24~-的乳腺癌干细胞比例的增加,导致了三阴性乳腺癌的化疗耐药。3.敲低Runx2逆转三阴性乳腺癌耐药细胞的耐药性除了与其调控TGF-β经典的Smads通路有关外还与其调控多耐药蛋白MDR1的表达有关。4.TGF-β对Runx2的表达也存在反馈调控作用,并且其诱导的Runx2的表达水平与其诱导的耐药水平正相关。