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原发性肝癌在我国癌症病死率中排名第二位,及早发现根治切除是目前提高治愈率的主要手段。目前临床常用的检测肝癌的手段主要是甲胎蛋白(alpha fetal protein, AFP)测定和各种影像学技术。由于早期病变内多为不成熟的幼稚血管,因此基于成熟灌注血管基础上的各种影像学对比剂增强技术无法检测早期病变。基于早期病变特点,设计特异性的诊断方案,提高检测水平是早期发现病变提高治疗效果的有效途径。因此利用肝癌早期细胞表达的特异性物质作为靶点,设计与靶点特异性结合的分子显影对比剂,增强显影效果,是提高影像学诊断水平的可行途径。有效的分子显影对比剂应具备一下特点：一、增加诊断的敏感性与特异性；二、提高组织特异性；三、降低内在的显影假象；四、在诊断过程中获取更多有效功能信息。因此本课题设计以生物可降解型材料作为载体,与具有良好显影功能的钆结合,制备四种具有优良显影能力的分子显影对比剂,提高核磁共振的灵敏度,提高肝癌特别是早期肝癌的诊断水平。其一是,钆喷酸葡胺固体脂质纳米复合物(SLN/Gd-DTPA nanocomplexes)分子显影对比剂；其二是,聚乳酸-聚乙二醇／钆喷酸葡胺纳米复合物(PLA-PEG/Gd-DTPA nanocomplexes)分子显影对比剂；其三是,钆标记聚乳酸-聚乙二醇纳米粒(Gd labeled PLA-PEG nanoparticles)分子显影对比剂；其四是,血管内皮生长因子抗体(anti-VEGF)-钆标记聚乳酸-聚乙二醇-聚赖氨酸纳米粒(anti-VEGF-PLA-PEG-PLL-Gd)主动靶向分子显影对比剂。系统研究了四种生物可降解分子显影对比剂的药剂学特征和生物学特征,探讨其作为分子显影剂的应用前景。课题主要研究方法与结果如下：一、Gd-DTPA固体脂质纳米复合物用于分子显影的初步研究选用阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)作为固体脂质纳米粒(Solid lipid nanoparticles,SLN)的电荷调节剂,采用溶剂乳化挥发法制备阳离子固体脂质纳米粒,纳米粒与钆喷酸葡胺注射液(Gd-DTPA)分子自组装制备SLN/Gd-DTPA纳米复合物；透射电镜观察纳米粒形态；ZETASIZER3000粒度分析仪测定其粒径、粒度分布和zeta电位。考察SLN/Gd-DTPA纳米复合物的体外显影效果及其在血浆中的稳定性,验证其作为分子显影剂的应用前景。结果显示溶剂乳化挥发法制备的阳离子SLN呈球形或类球形,平均粒径188.5±2.98nm,zeta电位+19.83±0.90mV,制得的SLN/Gd-DTPA纳米复合物平均粒径为196.1±2.01nm, zeta电位为+17.12±0.61mV。纳米复合物体外显影表明,与游离Gd-DTPA比较,SLN/Gd-DTPA纳米复合物具有较强显影能力,其显影强度与SLN/Gd-DTPA纳米复合物的浓度呈线形关系(r=0.9770)。纳米粒血浆稳定性考察表明SLN/Gd-DTPA纳米复合物在血浆中孵育2h仍具有良好稳定性,实验条件下血浆蛋白不能解析SLN/Gd-DTPA纳米复合物。利用阳离子固体脂质纳米粒和Gd-DTPA通过分子自组装制备SLN/Gd-DTPA纳米复合物分子显影对比剂,制备工艺简单,纳米复合物药剂学性质优良,是一种极富应用潜力的核磁共振(MRI)分子显影对比剂。二、PLA-PEG/Gd-DTPA纳米复合物用于分子显影的初步研究为了获得比SLN更便于进行进一步修饰的分子显影对比剂,选用生物可降解的材料PLA-PEG为载体制备Gd-DTPA纳米复合物。PLA-PEG末端可设计成有化学活性的残基,因而较SLN具有更好的可修饰性,为制备具有主动靶向性的分子显影对比剂提供了可能。因此,本部分选用PLA-PEG为材料,采用改良溶剂扩散法制备PLA-PEG纳米粒,与Gd-DTPA自组装,制得粒径为187.9±2.30nm, zeta电位为-12.36±3.58mV,多分散系数为0.108的纳米复合物。考察PLA-PEG/Gd-DTPA纳米复合物的血浆稳定性、体外磁共振显影和体内磁共振显影,结果显示该纳米复合物与人血浆孵育2小时后仍保持良好的显影能力。显影加强能力与纳米复合物的浓度呈正相关性(r=0.987)。与商品化对比剂Gd-DTPA相比,纳米复合物分子显影对比剂可以获得更好的加强信号及更长的体内显影时间,所制备的纳米复合物作为分子显影剂具有较好的前景。三、钆标记PLA-PEG纳米粒用于分子显影对比剂的研究使用化学合成的方法将Gd接合至材料上,制备的纳米粒分子显影对比剂与自组装比较,应具有更好的稳定性和更好的显影特性。所以,本部分利用Gd与DTPA特异性结合反应的特性,通过化学合成的方法将DTPA接合至生物可降解的PLA-PEG上获得PLA-PEG-DTPA。用此新材料制备纳米粒,表面有暴露的DTPA基团,可与GdCL3鳌合,由此制得钆标记的PLA-PEG纳米粒分子显影对比剂。考查其理化性质及细胞毒性、体外显影与大鼠体内显影效果。结果显示制得的Gd标记纳米粒平均粒径为265.9±6.7nm, zeta点位为-18.71±2.3 mV,多分散系数为0.104。Gd标记纳米粒分子显影对比剂的细胞毒性与商品化对比剂Gd-DTPA相比没有显著差异。在3.0T磁共振仪检测中,r1值为18.865mM-1s-1,r2值为24.863mM-1s-1。在Gd剂量相同时,纳米粒分子显影对比剂体内信号加强显著大于Gd-DTPA, T1像保留时间为4.5小时,肝脏的靶向效率为14.57。因此,钆标记的纳米粒可作为肝被动靶向分子显影对比剂。四、抗体-钆标记PLA-PEG-PLL纳米粒主动靶分子显影对比剂的研究PLA-PEG-PLL比PLA-PEG-NH2具有更多易于修饰的多氨基官能团,有利于制备主动靶向分子显影对比剂。本部分利用PLA-PEG-PLL材料的多氨基,使用合成的方法DTPA接合至材料上制得PLA-PEG-PLL(DTPA);与NHS-Biontin反应制得PLA-PEG-PLL(Biotin); PLA-PEG-PLL分别与PLA-PEG-PLL(DTPA)和PLA-PEG-PLL(Biotin)混合通过溶剂扩散法制备纳米粒,利用纳米粒表面活性氨基经戊二醛醛基化后将血管内皮生长因子抗体(anti-VEGF)接合至纳米粒表面得到抗体标记纳米粒,最后经纳米粒表面DTPA与GdCL3鳌合制备而得到anti-VEGF-钆标记主动靶向纳米粒分子显影对比剂；利用多氨基活性基团进行生物素化得PLA-PEG-PLL(biotin),与PLA-PEG-PLL混合制得纳米粒后利用生物素-亲和素(biotin-avidin)特异反应与avidin-异硫氰酸荧光素(FITC)偶合,制备anti-VEGF-FITC标记PLA-PEG-PLL纳米粒。制得的钆标记PLA-PEG-PLL纳米粒、anti-VEGF-FITC标记PLA-PEG-PLL纳米粒、anti-VEGF-钆标记PLA-PEG-PLL纳米粒平均粒径分别为69.8±5.3nm、82.5±5.8nm和85.8±7.2nm,zata电位分别为23.03±4.6mv、22.77±2.5mv和21.63±2.4mv,血浆稳定性结果显示anti-VEGF-钆标记PLA-PEG-PLL纳米粒分子显影对比剂与血浆孵育4小时未观察到聚集现象,纳米粒具有良好的血浆稳定性。经3.0T磁共振仪检测,T1驰豫率R1值为18.394 mM-1 s-1, T2驰豫率R2值为24.35mM-1s-1。纳米粒分子显影对比剂体内加强信号显著大于Gd-DTPA, H22小鼠肝癌移植瘤T1像保留时间为4.5小时,H22小鼠肝癌模型中与Gd-DTPA注射液相比,anti-VEGF-钆标记纳米粒肿瘤靶向效率为46.9；与钆标记PLA-PEG-PLL纳米粒纳米粒相比,肿瘤靶向效率为3.2。说明所制备的anti-VEGF-钆标记PLA-PEG-PLL纳米粒可特异识别肝癌早期血管形成过程表达的血管内皮生长因子,对肝癌肿瘤具有显著的主动靶向显影诊断效率,达到分子显影对比剂所需的靶向强化要求,所制备的anti-VEGF-钆标记PLA-PEG-PLL纳米粒可作为分子显影对比剂应用于肝癌早期诊断,具有良好的临床应用前景。综上所述,SLN/Gd-DTPA纳米粒复合物作为分子显影对比剂具有较好的稳定性和良好的体外显影效果,并具有被动靶向肝脏的潜力。PLA-PEG/Gd-DTPA纳米复合物其体外显影能力优于SLN/Gd-DTPA纳米粒复合物,在大鼠体内具有良好的肝脏靶向效率。钆标记PLA-PEG纳米粒显著提高了对比剂的驰豫率,在减低浓度即可获得良好的显影效果,在大鼠体内呈现良好的肝脏靶向效率优于SLN/Gd-DTPA和PLA-PEG/Gd-DTPA纳米复合物。抗体-钆标记PLA-PEG-PLL纳米粒则显示了特异的主动靶向于肿瘤血管内皮生长因子。因此,本课题所制备的四种纳米粒分子显影对比剂具有显著的提高对比剂显影能力,提高其对肝脏的靶向效率从而提高肝癌的诊断效率的分子显影对比剂,是具有一定开发前景的分子显影对比剂载体。