研究背景目前肥胖、糖尿病已成为世界流行病。据统计:到2007年,全世界超重者已超过11亿,其中3.12亿人口为肥胖者。糖尿病也已成为危害全球人民健康的重要问题。到2030年,预计全世界糖尿病患病人数将从2000年的1.71亿发展为3.66亿。肥胖,尤其是腹型肥胖,是导致胰岛素抵抗(Insulin resistance)的重要因素。而肥胖、2型糖尿病和妊娠糖尿病的主要病理生理特征亦为胰岛素抵抗。妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)是糖尿病的常见类型,也是较常见的围产期疾病之一,对母婴均会造成很大影响,使围产期并发症增加。随着经济发展和生活方式的改变,妊娠糖尿病发病率正在逐年上升,发展中国家GDM的发病率在过去20年内从2.9%上升到8.8%。逐年增加的GDM不仅影响围产期母婴健康,而且增加母婴将来患2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)及代谢综合征(Metabolic syndrome, MS)的风险。目前其发病机制尚不完全清楚。现在研究认为,GDM是2型糖尿病的早期阶段,其发生和妊娠期胰岛素抵抗有关。肥胖抑制素(Obestatin)是与编码胃促生长素(Ghrelin)的同一基因共同编码的23个氨基酸的多肽,最早报道可以通过与G蛋白偶联孤儿受体39(GPCR39)的作用减少摄食,减轻体重,减慢胃排空和抑制肠能动性。另外,在出生后的胰腺,胰岛素和Obestatin的浓度有明显的相关性。目前,obestatin对糖脂代谢的研究还存在很多的争议,有研究提示obestatin可能会参与机体糖代谢的调节以及与机体的糖代谢异常有关。国外学者研究表明,Obestatin抑制细胞因子诱导的胰腺β细胞凋亡,促进细胞增殖,促进胰岛素分泌。在分子水平,胰岛素的信号是以胰岛素受体(insulin receptor, IR)的激活导致自身磷酸化开始,然后激活的受体引起几个底物的酪氨酸磷酸化,包括胰岛素受体底物1和2(insulin receptor substrate-1 and 2, IRS-1, IRS-2)等。IRS-1和IRS-2酪氨酸磷酸化后,会激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI-3K) ,激活的PI3-K引起蛋白激酶B(PKB/Akt)丝氨酸磷酸化。而越来越多的证据表明棕榈酸诱导的胰腺β细胞的凋亡与蛋白激酶B磷酸化的抑制有关。目前关于obestatin与糖代谢的关系还无太多的研究,而其与妊娠糖尿病的关系更未见文献报导。因此,本研究拟从以下几个方面探讨obestatin与糖尿病及胰岛β细胞功能的关系,以期为目前相关问题的解决提供一些新的可能思路。①妊娠糖尿病患者外周血obestatin水平变化及其与胰岛素抵抗的关系;②obestatin对高脂诱导的胰腺β细胞株INS-1存活和凋亡的作用;③obestatin抑制高脂诱导的胰腺β细胞株INS-1凋亡信号通路的研究。第一部分:妊娠糖尿病患者Obestatin水平及其与胰岛素抵抗的关系目的:研究妊娠糖尿病患者和正常妊娠患者外周血肥胖抑制素(obestatin)水平及其与胰岛素抵抗的关系。方法:检测32例孕24-30周妊娠糖尿病患者和同期36例健康孕妇空腹胰岛素、空腹血糖、糖化血红蛋白、血脂谱和Obestatin水平,计算孕前体重指数、稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。数据分析采用独立样本t检验、直线相关分析和多元逐步回归分析。结果:1.妊娠糖尿病组的孕前体重指数、甘油三酯、低密度脂蛋白均明显高于对照组(P<0.01)。与对照组相比,妊娠糖尿病组Obestatin水平明显降低(P<0.01),妊娠糖尿病组空腹血糖、2h血糖、空腹胰岛素水平、HbA1c和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)明显高于对照组(P<0.01)。与正常妊娠组相比,妊娠糖尿病组Obestatin水平明显降低(280.56±61.40 ng/L vs 232.59±58.39,P<0.01)。2.直线相关分析显示,obestatin水平与孕前体重指数(r=-0.50,p<0.01)、糖化血红蛋白(r=-0.34,p<0.01)、空腹血糖(r=-0.38,p<0.01)、空腹胰岛素(r=-0.45,p<0.01)、甘油三脂(r=-0.35,p<0.01)和稳态模型胰岛素抵抗指数(r=-0.52,p<0.01)呈负相关。多元逐步回归分析显示,胰岛素抵抗指数和孕前体重指数是obestatin水平的独立影响因素。结论:提示obestatin可能参与妊娠糖尿病的代谢紊乱。第二部分: Obestatin对高脂环境中胰腺β细胞株INS-1存活和凋亡的作用目的探讨肥胖抑制素(Obestatin)在高脂环境中胰腺β细胞株INS-1存活和凋亡中的作用。方法大鼠胰腺β细胞株INS-1由第二军医大学生理教研室任安经老师惠赠。应用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测各组细胞存活率,INS-1细胞分为①5%牛血清白蛋白组(BSA)②5%牛血清白蛋白+1nM肥胖抑制素(BSA+OB1nM)③5%牛血清白蛋白+10nM肥胖抑制素(BSA+OB10nM)④5%牛血清白蛋白+100nM肥胖抑制素(BSA+OB100nM)⑤5%牛血清白蛋白+500nM肥胖抑制素(BSA+OB500nM)⑥0.5mM游离脂肪酸(PA)⑦0.5mM游离脂肪酸+1nM肥胖抑制素(PA+OB1nM)⑧0.5mM游离脂肪酸+10nM肥胖抑制素(PA+OB10nM)⑨0.5mM游离脂肪酸+100nM肥胖抑制素(PA+OB100nM)⑩0.5mM游离脂肪酸+500nM肥胖抑制素(PA+OB500nM)共10组。应用膜连蛋白Ⅴ/碘化丙啶(ANNEXINⅤ/PI)双染的方法检测各组细胞凋亡率,INS-1细胞分为①5%牛血清白蛋白组(BSA)②5%牛血清白蛋白+100nM肥胖抑制素(BSA+OB)③0.5mM游离脂肪酸组(PA)④0.5mM游离脂肪酸+10-7mMol/l肥胖抑制素组(PA+OB)共4组。用SPSS17.0软件对数据进行各组间单向方差分析One-Way ANOVA,P<0.05差异有统计学意义。结果1、肥胖抑制素拮抗游离脂肪酸诱导的INS-1细胞的死亡。(1)无PA干预时,Obestatin剂量依赖性的促进细胞增殖,1nM的Obestatin干预后,细胞存活率有所上升,但无统计学差异。10nM的Obestatin干预后,细胞存活率有所上升,存活增加了22%,差异有统计学意义(BSA+OB10nM vs BSA,p<0.05)。100nM的Obestatin作用最强,存活增加了36%(BSA+OB100nM vs BSA,p<0.01)。500nM的Obestatin干预后细胞存活增加了28%(BSA+OB500nM vs BSA,p<0.01)。(2)棕榈酸(PA)干预后细胞存活较牛血清白蛋白(BSA)组下降了35%(PA vs BSA,p<0.01)。加用Obestatin后剂量依赖性阻止棕榈酸(PA)诱导的脂毒性,100nM的Obestatin作用最强,较棕榈酸(PA)组存活增加了34%(PA+OB100nM vs PA,p<0.01)。1nM的Obestatin干预后,细胞存活率有所上升,但无统计学差异(PA+OB1nM vs PA,p>0.05)。10nM为最低有效浓度,存活增加了23%(PA+OB10nM vs PA,p<0.05)。500nM的Obestatin干预后细胞存活增加了25%(PA+OB500nM vs PA,p<0.01)。2.PA干预24小时后凋亡率达到24.12%,与BSA组相比明显增加(PA vs BSA,p<0.01),加用OB(100nM)后凋亡率下降15.78%(PA+OB vs PA,p<0.01)(图2)。结论Obestatin可以促进胰腺β细胞INS-1存活;抑制高脂诱导的胰腺β细胞INS-1凋亡。第三部分:Obestatin抑制高脂诱导的胰腺β细胞株INS-1凋亡信号通路的研究目的探讨肥胖抑制素(Obestatin)在高脂诱导的胰腺β细胞株INS-1凋亡中的作用及相关的信号通路。方法应用膜连蛋白Ⅴ/碘化丙啶(ANNEXINⅤ/PI)双染的方法检测各组细胞凋亡率,INS-1细胞分为①5%牛血清白蛋白组(BSA);②100 nmol/L肥胖抑制素组(OB);③50μmol/L LY294002组(LY);④0.5 mmol/L棕榈酸组(PA);⑤0.5 mmol/L PA+50μmol/L LY组(PA+LY);⑥0.5 mmol/L PA+100 nmol/L OB组(PA+OB);⑦0.5 mmol/L PA+100 nmol/L OB+50μmol/L LY组(PA+OB+LY)。Western blot方法检测细胞中蛋白激酶B(Ser473)磷酸化水平,①INS-1细胞分为A.5%牛血清白蛋白组(BSA)B.0.5mmol/l游离脂肪酸组(PA+OB 0min)C. 0.5mmol/l游离脂肪酸+100nmol/L肥胖抑制素组15分钟(PA+OB 15min)D. 0.5mmol/l游离脂肪酸+100nmol/L肥胖抑制素组30分钟(PA+OB 30min)E. 0.5mmol/l游离脂肪酸+100nmol/L肥胖抑制素组60分钟(PA+OB 60min);②INS-1细胞分为A.0.5mmol/l游离脂肪酸组(PA)B.0.5mmol/l游离脂肪酸组+1nmol/L肥胖抑制素组30分钟(PA+OB 1nM)C. 0.5mmol/l游离脂肪酸+10nmol/L肥胖抑制素组30分钟(PA+OB 10nM)D. 0.5mmol/l游离脂肪酸+100nmol/L肥胖抑制素组30分钟(PA+OB 100nM)E. 0.5mmol/l游离脂肪酸+500nmol/L肥胖抑制素组30分钟(PA+OB 500nM);③INS-1细胞分为A.0.5mmol/l游离脂肪酸组(PA) B.0.5mmol/l游离脂肪酸组+50μmol/L LY294002(PA+LY)C. 0.5mmol/l游离脂肪酸+100nmol/L肥胖抑制素组(PA+OB)D. 0.5mmol/l游离脂肪酸+100nmol/L肥胖抑制素组+50μmol/L LY294002(PA+OB+LY)。用SPSS17.0软件对数据进行各组间单向方差分析One-Way ANOVA,P<0.05差异有统计学意义。结果(1)加用PI3K的抑制剂LY294002后凋亡率明显增加(PA+OB vs PA+OB+LY ,p<0.01)。LY294002减弱了肥胖抑制素对脂毒性诱导凋亡的保护作用(PA+OB vs PA+OB+LY, p<0.01)。(2) 100 nmol/L肥胖抑制素分别作用INS-1细胞0、15、30、60 min后,磷酸化蛋白激酶B表达在肥胖抑制素作用15分钟后即有明显升高(0.5 mmol/L棕榈酸+100 nmol/L肥胖抑制素15min组与5%牛血清白蛋白组相比,P<0.01),30 min后达到高峰(0.5 mmol/L棕榈酸+100 nmol/L肥胖抑制素30min组与5%牛血清白蛋白组相比,P<0.01)。(3) 1、10、100、500 nmol/L肥胖抑制素作用INS-1细胞30 min后,10 nmol/L肥胖抑制素组磷酸化蛋白激酶B表达即有明显升高(0.5 mmol/L棕榈酸+10nmol/L肥胖抑制素组与0.5 mmol/L棕榈酸组相比,P<0.05),100 nmol/L肥胖抑制素组磷酸化蛋白激酶B表达达高峰(0.5 mmol/L棕榈酸+100 nmol/L肥胖抑制素组与0.5 mmol/L棕榈酸组相比,P<0.01)。(4)加用LY294002后,0.5 mmol/L棕榈酸+100 nmol/L肥胖抑制素+50μmol/L LY294002组与0.5 mmol/L棕榈酸+100 nmol/L肥胖抑制素组相比,磷酸化蛋白激酶B蛋白表达明显受到抑制(P<0.05)。结论Obestatin可以抑制高脂诱导的胰腺β细胞株IS-1凋亡,部分与磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI-3K/PKB)信号通路有关,在糖尿病的防治中可能有一定的意义。