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大量研究证实,以DC为代表的抗原提呈细胞在体内外可有效激活和扩增肿瘤抗原特异性T细胞而发挥抗肿瘤作用,但因大量制备的技术困难等原因限制了其临床应用。人工抗原递呈细胞(aAPC)是新近兴起的一种替代DC疗法的免疫治疗新策略,是在一定的载体表面展现pMHC及共刺激分子、粘附分子的配体或抗体等,模拟天然抗原递呈细胞诱导T细胞活化的双信号系统,包括以细胞为载体和以非细胞性物质为载体的aAPC等两类。众多研究小组已经从不同侧面证实了以细胞大小的磁珠或胶乳微球为载体的aAPCs是在体外有效扩增抗原特异性T细胞、甚至NK细胞的强有力工具,为肿瘤或慢性感染性疾病的过继细胞免疫治疗提供了新方法,并已应用于临床。然而,这种非细胞性的人工抗原递呈细胞在体内能否诱导主动免疫反应的研究却少有报道。关键点是其表面缺乏黏附分子和生物膜的流动性,在体内能否与特异性T细胞接触并形成免疫突触进而活化T细胞值得探讨。
本课题以小鼠黑色素瘤抗原TRP2为肿瘤靶抗原,以直径5.0μm的胶乳微球为载体,在其表面共价吸附H-2Kb／TRP2180-188分子、抗鼠CD28单抗和抗鼠CD137(4-1BB)单抗,制备成人工抗原递呈细胞,继而通过尾静脉注射和皮下多点注射等给药方式接种Naive小鼠和靶抗原刺激后的免疫记忆小鼠,观察肿瘤抗原特异性T细胞的活化和增殖程度以及杀瘤细胞活性的变化,从而比较aAPC在体内对静止T细胞和活化或记忆状态T细胞的激发能力。主要结果如下:
1、利用稀释复性法在体外折叠制备了两种pMHC单体:H.2Kb／TRP2180-188和H.2Kb／OVA257-264,继而利用生物素.亲和素系统制备了荧光素PE标记的四聚体。经过H-2Kb分子空间构象特异性单抗的染色和流式细胞分析,证实自制的pMHC单体与国外进口的同种单体具有相等的荧光染色强度,提示分子折叠正确。
2、以Naive C57BL／6小鼠为动物模型,将人工抗原递呈细胞在第0天和12天进行两次尾静脉注射,第19天行皮下多点注射,5天后杀鼠取脾细胞,在体外与TRP2抗原肽共孵育1-3天。期间于不同时间点取脾细胞进行CD69和CD25荧光染色以检测活化T细胞的比例、H-2Kb／TRP2180-188四聚体和H-2Kb／OVA257-264四聚体荧光染色和细胞内IFN-γ的荧光染色以检测TRP2抗原特异性T细胞的比例,并在体外与肿瘤细胞株混合培养检测特异性CTL的杀瘤细胞活性。结果显示:与对照组相比,aAPC的免疫接种使C57BL／6鼠脾细胞群中CD69+／CD8+细胞频率增高至3.0倍；CD25+／CD8+细胞频率增高至3.8倍；TRP2-tetramer+／CD8+细胞频率增高至7.2倍；分泌IFN-γ的CD8+细胞比例增高至6.2倍；对黑色素瘤B16细胞的特异性杀伤能力比对照组平均提高了109.2％(50:1)、115.5％(25:1)和90.3％(12.5:1)。据此可以认为aAPC能够在Naive小鼠体内有效诱导肿瘤抗原特异性T细胞的活化和增殖并增强其杀瘤细胞活性。
3、建立靶抗原预刺激小鼠模型并aAPC接种:皮下多点注射B16黑色素瘤细胞两次,3000个／鼠／次,间隔10天。第二次注射B16后第10天开始进行aAPC接种,方案与Naive鼠实验模型的接种方案相同。在末次接种aAPC后5天杀鼠取脾脏,与TRP2肽共孵育后同上进行各项免疫指标的检测。结果显示:与对照组相比,aAPC的免疫接种使C57BL／6鼠脾细胞群中CD69+／CD8+细胞频率增高至3.6倍；CD25+／CD8+细胞频率增高至5.2倍；TRP2-tetramer+／CD8+细胞频率增高至6.7倍；分泌IFN-γ的CD8+细胞比例增高至7.0倍；对黑色素瘤B16细胞的特异性杀伤能力比对照组提高了188.5％(50:1)、211.0％(25:1)和227.5％(12.5:1)。与aAPC接种Naive鼠相比,aAPC接种抗原预刺激鼠激发的CD69+／CD8+细胞比例是前者的3.0倍；CD25+／CD8+细胞比例是前者的2.0倍；TRP2-tetramer+／CD8+细胞比例是前者的1.8倍；IFN-γ+／CD8+细胞比例是前者的3.6倍；在不同的效靶比例下,特异性杀瘤细胞活性的增强程度也由Na(i)ve鼠实验组的109.2％、115.5％和90.3％显著提升为188.5％、211.0％和227.5％。
这些结果显示:利用稀释法成功地制备了具有正确空间构象的H-2Kb／肽复合单体及四聚体；aAPC在Naive小鼠和抗原预刺激小鼠体内均能有效诱导肿瘤抗原特异性T细胞的活化和增殖并能增强特异性CTL的杀瘤细胞活性,其中在抗原预刺激鼠中的增强效应明显高于在Naive鼠中对静止T细胞的增强效应。提示了aAPC在肿瘤抗原特异性主动免疫治疗中的潜在应用价值。