水稻Fruit-Weight2.2-Like基因家族的功能研究

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西红柿的Fruit-Weight2.2 (FW2.2)基因被证明能够控制大约30%的果实重量。它的同源基因Fruit-Weight2.2-Like (FWL)也被证明在许多植物的生长发育中发挥着重要作用。例如,玉米中1个FWL基因Cell Number Regulator 1 (CNR1)能够负调控植株和器官的大小。水稻是人类重要的粮食作物,目前在水稻中有关FWL基因家族的研究还没有报道。因此,我们对水稻FWL基因家族(OsFWL)的分子特征和功能进行了初步研究。通过生物信息学、遗传转化和T-DNA插入突变体表型鉴定等方法研究了OsFWL基因的结构、表达和功能。主要结果如下:根据序列同源性和保守结构域分析,在水稻中发现8个FWL基因并命名为OsFWL1至OsFWL8。对OsFWL基因家族进行了一系列生物信息学分析,包括染色体定位、基因结构、蛋白保守结构域、进化关系,发现8个OsFWL基因分布在3条染色体上,其中OsFWL4、6、7、8在第3染色体长臂末端组成了1个基因簇,OsFWL基因编码的氨基酸序列都比较短,从136个到186个氨基酸,除了OsFWLl和OsFWL3其他的OsFWL蛋白都包含1个保守的CCXXXXCPC结构。合作单位在第3染色体长臂末端定位到1个粒重的QTL,推测位于该区段内的OsFWL基因簇可能是该QTL的有效基因。通过筛选获得了包含该基因簇的水稻珍汕97 BAC克隆,对其进行shotgun测序,获得了3个多态性标记,将该BAC克隆中包含OsFWL基因簇的片段用Not I酶切后连接到BIBAC载体上,然后遗传转化中花11。通过RT-PCR和表达谱数据分析了OsFWL基因的表达模式,发现OsFWL3只在抽穗期的穗中特异表达,OsFWL4在整个生育期的表达量很低。OsFWL5、 OsFWL6、OsFWL7在叶片中的表达量与叶片生长活力呈负相关。共表达分析结果显示OsFWL1、OsFWL2、OsFWL5与大量的锌指蛋白和泛素化相关蛋白共表达。通过水稻原生质体转化研究OsFWL蛋白的亚细胞定位,结果显示大部分的OsFWL为细胞膜蛋白,只有OsFWL8定位在细胞核内。为了进行体外酶活检测,原核表达和纯化了OsFWL1、OsFWL2、OsFWL4蛋白。对OsFWL家族部分基因进行了超表达和RNAi的水稻遗传转化,获得了独立的转基因植株。在TO代检测目的基因的表达量,结果显示在超表达和RNAi植株中,目的基因的表达量得到了上升和下降。其中超表达CNR1和OsFWL1均造成植株矮小,无分蘖,不结实的表型。插入突变体分析结果显示对比野生型osfwl3突变体的粒长增加了5.8%,粒重增加了5.3%。通过对颖壳内表皮进行扫描电镜观察发现osfwl3突变体粒长的增加主要是因为细胞数目的增加,而不是细胞尺寸的增加。同时利用Gus染色检测OsFWL3启动子的活性,发现OsFWL3的表达量和颖壳的生长活力负相关。osfwl5突变体的株高比野生型高12.5%,进一步分析发现主要是茎的第一节增长了。在水稻中有两个酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)调节亚基的同源蛋白,通过双分子荧光互补实验(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC)证明OsFWL1与OsO7g31280编码的蛋白互作,与Os1 0g41520编码的蛋白没有互作。这些结果为以后进一步研究OsFWL基因的功能提供了一个全面的基础。
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