木质纤维素是自然界最丰富的可再生生物质资源,其高效降解转化可以生产生物燃料和其它生物基产品,具有广阔的应用前景。自然界中存在着一些能够高效降解纤维素的微生物,其中,拟杆菌门成员往往通过基因组中的多糖利用座位（Polysaccharide utilization locus,PULs）基因簇编码的淀粉利用系统（Starch Utilization System,Sus）或类淀粉利用系统（Sus-like）实现多糖底物的降解、吸收与利用。拟杆菌门的哈氏噬纤维菌（Cytophaga hutchinsoni）是一种能够高效降解水不溶性结晶纤维素的好氧的革兰氏阴性菌。与已知的其它微生物降解纤维素的策略不同,C.hutchinsoni不分泌胞外游离的纤维素酶也不在细胞表面形成纤维小体结构,其纤维素酶结构中也不含明显的能够与纤维素结合的碳水化合物结合模块（Carbohydrate Binding Modle,CBM）,人们推测,C.hutchinsoni可能利用一种新颖的机制完成对结晶纤维素的高效降解,但是这种机制目前还不是十分清楚。本实验室研究发现,C.hutchiinsoni中可能存在一个与PULs类似的基因簇,即基因簇chu₁276～chu₁280。其中,chu₁276和chu₁277编码两个外膜蛋白,在纤维素降解过程中发挥非常重要的作用;chu₁280编码一个纤维素内切酶;c/hu₁278和chu₁279编码两个未知功能蛋白。本实验室已经对chu₁276～1278编码的三个非酶蛋白进行了研究,但chu₁279在纤维素降解中的作用还不是很清楚。本文围绕chu₁279在C.hutchinsonii降解纤维素中的功能展开研究,取得的主要研究结果如下:一、通过研究缺失突变株A1279的性质,证明chu 1279在C.hutchinsoii降解纤维素过程中发挥重要作用。构建了缺失突变株Δ/279,测定了突变体与野生型菌株在不同碳源下的生长、纤维素酶酶活以及纤维素吸附性质的差异。生长分析表明,突变株A/279丧失了利用结晶纤维素的能力,在以纤维素为唯一碳源的培养基上不生长。全菌体酶活测定结果表明,突变株中纤维素内切酶和β-葡萄糖苷酶酶活均下降约25%,但胞质中的CMCase酶活与pNPG酶活与野生型相比基本没有变化。此外,菌体与纤维素吸附能力测定结果表明,相较野生型菌株,突变株细胞对纤维素的吸附能力下降约30%。二、克隆表达了 CHU₁279重组蛋白,证明该重组蛋白具有纤维素吸附能力。成功构建了 CHU₁279重组蛋白工程菌株,利用亲和层析的方法对CHU₁279重组蛋白进行分离与纯化,获得电泳纯CHU₁279。经测定研究发现CHU₁279重组蛋白对纤维素具有明显的吸附能力,对木聚糖也有一定的吸附能力,但对木聚糖的吸附作用弱于纤维素。分析显示CHU₁279具有两个结构域,我们进一步将CHU₁279分成N端和C端两个结构域进行重组表达,发现C端结构域具有明显的纤维素吸附能力,而N端部分没有纤维素吸附能力。三、通过点突变对CHU₁279吸附纤维素的关键性氨基酸位点进行鉴定,证明Tyr253、Phe256和Phe343对CHU₁279蛋白对纤维素的吸附是必须的。通过对CHU₁279蛋白结构的分析,选定可能参与纤维素结合的Trp89、Phe92、Phe180、Asn182、Tyr253、Phe256、Phe343、Asn345 八个氨基酸位点进行Ala突变,将突变体在大肠杆菌里进行表达纯化获得突变体重组蛋白。通过与野生型蛋白在纤维素吸附能力上的差异比较分析,结果表明W89A、F92A、F180A和N182A突变体蛋白与野生型蛋白的纤维素吸附能力几乎没有差别;N345A突变体蛋白吸附能力有小幅度下降;而Y253A、F256A和F343A突变体蛋白则完全丧失了吸附能力。圆二色谱分析表明,这三个突变体蛋白的二级结构并未受到明显影响。结果表明Tyr253、Phe256和Phe343位点的氨基酸在吸附纤维素过程中发挥着非常重要作用。