[背景及目的]转化生长因子beta1 (TGF-β1)信号通过Ⅰ型和Ⅱ型TGF-β受体(TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ)途径,可抑制肿瘤细胞生长。在肿瘤发生发展过程中,肿瘤细胞常常通过TGF-β受体的下调或者突变,逃避TGF-β信号对其生长抑制作用。但是,TGF-β1激活的信号还能促进肿瘤细胞迁徙,具有促肿瘤的作用,这就是著名的TGF-β“双向”作用。恶性肿瘤细胞如何逃避TGF-β信号的生长阻滞作用,并促进肿瘤转移能力,其机制仍不完全清楚。本研究旨在探讨TGF-βRII的表达和分子状态在膀胱癌肿瘤中的作用及其机制,以及与临床关系及其意义,为以其为靶点的肿瘤干预策略提供实验依据。[方法]1. TGF-β1及其TGF-p受体在多种肿瘤细胞系中的表达检测1)应用Real-time PCR检测各种肿瘤细胞系(乳腺癌,肝癌,肺癌,胃癌,子宫颈癌,白血病,前列腺癌,黑色素瘤及膀胱癌细胞)中TGF-βR I,TGF-pRⅡ, TGF-β1的表达2)应用流式细胞术(FCM)检测L02,MCF-7,A549,T24,ScaBER和BIU-87细胞表面TGF-βRⅡ的表达,胞浆中TGF-β1的表达3)应用细胞免疫组化法(细胞爬片)检测L02,MCF-7,A549,T24,ScaBER和BIU-87细胞表面的TGF-βRⅡ的染色程度2. L02, ScaBER和T24细胞中TGF-β信号的阻断试验1)将本室构建的可溶性Ⅱ型TGF-β受体(Fc:TβRII;与TGF-pRⅡ竞争结合TGF-β1,阻断TGF-p信号通路)转染至实验细胞中,应用Western blot方法检测细胞上清中Fc:TβRII的表达2)将Smad2/3的siRNA转染肿瘤细胞,应用抗Smad2/3抗体,Western blot的方法检测细胞中Smad2/3的表达3. TGF-βRⅡ对肿瘤细胞生长、细胞活力影响的实验1)用PKH-26将目的细胞染色后,应用流式细胞术检测48 h后各组细胞的增殖水平(用刺激指数表示)2)应用Transwell实验检测肿瘤细胞的侵袭和转移情况,用苏木素-伊红染色后随机选取五个视野计数分组：①对照组；②Fc:TβRⅡ转染组；③TGF-β1刺激组；④Si-Smad2/3组。4.膀胱癌细胞及组织标本中TGF-βRⅡ序列测定,及其突变分析首先,针对TGF-βRⅡ编码区第383-2086bp设计TGF-βRⅡ的测序引物；应用RT-PCR方法进行TGF-βRⅡ基因扩增；然后,利用琼脂糖凝胶电泳显示目的条带,用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行产物回收,纯化；送至上海英骏公司进行序列测定；利用pubmed中BLAST将测序结果与TGF-βRⅡ基因序列进行比对,分析5.检测膀胱癌细胞中TGF-β1/TGF-βRⅡ信号激活的下游通路1)应用Western blot检测TGFβ经典信号通路中的Smad磷酸化形式pSmad蛋白的表达2)应用IP(免疫共沉淀)检测TGF-βRⅡ复合体与Smad的结合3)在TGFβ1 (2ng/ml)刺激0 h,2 h和4 h不同时间段,应用Real-time PCR检测L02,ScaBER和T24细胞中增殖相关基因p15,细胞分裂周期蛋白Cdc25A及促迁移活性的转录因子CUTL1的表达4)在TGFβ1 (2ng/ml)刺激0 h,4 h和8 h不同时间段,应用Western blot检测实验细胞中增殖及侵袭转移相关基因的表达6.从膀胱癌标本中分离原代细胞后,检测TGFβ信号对TGF-βRⅡ突变群(a)与未突变群(b)生物学特性的影响1)从膀胱癌组织标本中分离原代膀胱癌细胞2)应用免疫组化试验检测a组和b组细胞表面TGF-βRⅡ的表达3)利用FCM检测膀胱癌原代细胞的增殖能力(SI)分组：①0 h对照组；②24 h对照组；③24 h刺激组(TGF-p1)4)利用Transwell侵袭转移试验检测膀胱癌原代细胞的活力和迁移能力；分组：①对照组；②TGF-p1刺激组；③Fc:TβRII转染组5)利用RT-PCR检测TGF-β1刺激0 h,2 h和4 h后,a,b两组中p15,Cdc25A和CUTL1的表达[结果]1. TGF-β1在大多数肿瘤细胞中过表达,而TGF-pR I和TGF-βRⅡ在多种人类肿瘤细胞表面低表达,仅仅在人类膀胱癌细胞株T24表面,TGF-pRⅡ高表达,通过序列分析,在跨膜区的116位,118位,以及胞浆段269位发生点突变；269位的Ser/Thr激酶域的G→A (Glu269→Lys)点突变,致使蛋白质变性,由酸性氨基酸转换为碱性氨基酸。2.在TGF-p1刺激下,IP试验证明上述突变不影响TGF-PRⅡ与Smad2/3的结合,而且增殖试验结果表明TGF-pRⅡ的突变,反而解除了TGF-β1信号对肿瘤生长的抑制作用；Transwell试验说明发生点突变的TGF-pRⅡ/TGF-p信号能促强肿瘤细胞的运动和迁移能力。3.进一步运用RT-PCR和Western blot试验,对下游细胞增殖相关基因p15和Cdc25A及动力相关基因CUTL1的检测发现,TGF-βRⅡ突变体介导的信号途径能下调p15的表达,上调Cdc25A的表达,同时提高CUTL的表达,不抑制肿瘤的生长,而且促进了肿瘤细胞的侵袭转移能力。4.膀胱癌细胞系以及原代膀胱癌细胞中,转染重组质粒Fc:TβRII或Smad2/3的siRNA, TGF-p信号被阻断；发生TGF-βRII突变的癌细胞群中,p15和Cdc25A的表达无明显变化,但CUTL1的表达明显上调；5.在膀胱癌标本中,TGF-PRⅡ基因发生的G→A点突变(与膀胱癌细胞系T24中的TGF-pRⅡ突变类型一致)比例高达39.1%,与膀胱瘤临床分期中的T2级(P=0.007,<0.01)以及病理分级的高级别瘤(P=0.003,<0.01)密切相关。[结论]本实验研究首次发现TGF-βRⅡ在膀胱癌细胞系中的点突变,与膀胱移行上皮癌T24的侵袭转移密切相关,并在高转移,高侵袭的膀胱癌病人的肿瘤标本中发现同样的突变类型,说明TGF-βRⅡ的点突变很可能为膀胱癌转移的重要标志,这为TGF-β1信号在肿瘤发生中的所发挥的调节作用提供了证据,并且为进一步的机制研究提供了可靠的线索,对于目前以TGF-β1为靶点的肿瘤治疗,特别是膀胱癌病人的治疗,提供了新的依据和信息。