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背景与目的 铜绿假单胞菌是医院感染的重要病原体，常对多种抗菌药物具有很高的耐药性。近年来，多重耐药铜绿假单胞菌在不断增多。尤其值得注意的是，随着具有很强抗菌活性的碳青霉烯类抗生素的大量使用，对碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌也在不断上升。因此，对铜绿假单胞菌耐药机制的研究成为世界各国学者关注的热点。产金属β-内酰胺酶作为引起铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要机制，可导致铜绿假单胞菌对包括碳青霉烯类抗生素在内的所有β-内酰胺类抗生素耐药，并且目前临床没有安全有效的金属酶抑制剂，给治疗带来了极大的困难。本研究旨在了解目前儿科临床分离多重耐药铜绿假单胞菌的耐药性特点，及对碳青霉烯类抗生素的耐药情况，检测碳青霉烯耐药菌株产生金属酶的耐药表型、基因型和基因亚型，分析不同基因型的特征，以助于指导临床合理使用抗生素。
方法 本研究共收集北京儿童医院2003年12月～2005年11月两年住院患儿中分离出的120株多重耐药铜绿假单胞菌，采用临床实验室标准化研究所(CLSI，原NCCLS)推荐的琼脂稀释法测定抗菌药物的MICs(MinimumInhibitoryConcentrations)值，使用WHONET5.3软件和SPSS11.5软件进行数据分析。对碳青霉烯耐药株，使用E试验法检测产金属酶的耐药表型，PCR技术检测产金属酶的四种(IMP、VIM、SPM和GIM)基因型。对PCR反应产物进行DNA测序，将得到的拼接序列与GenBank中Blast进行同源分析，确定其基因亚型。
结果 1.多重耐药铜绿假单胞菌对单环β-内酰胺类抗生素氨曲南的耐药率最高，为86.7％，三代头孢菌素中对头孢噻肟和头孢哌酮的耐药率高达80％以上，对四代头孢菌素头孢吡肟的耐药率(46.7％)略高于对三代头孢菌素头孢他啶的耐药率(45.8％)，头孢菌素中头孢他啶保持了相对较好的抗菌活性。β-内酰胺加酶抑制剂类抗生素中，头孢哌酮/舒巴坦(60.0％)的耐药率高于哌拉西林/他唑巴坦(37.5％)。对环丙沙星耐药率最低，仅为2.5％。其中，对碳青霉烯类抗生素耐药的菌株59株，占49.2％。对亚胺培南和美洛培南的耐药率分别为34.2％和35.8％，两者MIC50和MIC90相同，分别为4μg/ml和32μg/ml。碳青霉烯耐药株对头孢他啶、头孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦的不敏感率高于非耐药株，差异有显著性(81.4％vs54.1％，76.3％vs49.2％，52.5％vs26.2％，P＜0.05)。且耐药模式分析显示，碳青霉烯耐药株对除阿米卡星和环丙沙星以外11种抗生素均耐药的15株，占25.4％。血液科与内科、ICU比较，分离的多重耐药铜绿假单胞菌对β-内酰胺类抗生素的不敏感率高。
2.对59株碳青霉烯耐药株检测金属酶表型，29株阳性，占49.2％。PCR扩增IMP、VIM、SPM和GIM四种金属酶基因型，39株阳性，占66.1％，其中IMP型阳性35株，占89.7％，VIM型阳性4株，占10.3％。未检测出SPM型和GIM型金属酶。碳青霉烯耐药株产金属酶率为66.1％，E试验法检测金属酶表型存在14株假阴性和4株假阳性结果。产金属酶的菌株对哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦的不敏感率高于非产金属酶菌株，差异有显著性(71.8％vs30.0％，59.0％vs25.0％，P＜0.05)。其它β-内酰胺类抗生素头孢噻肟、头孢哌酮、头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦的MIC50和MIC90均≥256μg/ml，高于非产金属酶菌株。
3.测序结果显示，35株产IMP型金属酶的核苷酸序列相同，4株产VIM型金属酶的核苷酸序列相同，分别100％同源。IMP型测序结果对应GenBank中IMP-1亚型序列，为产IMP-1亚型金属酶的铜绿假单胞菌，与其对应序列AY625687.1比较，有99％同源性，仅发生了一个氨基酸突变。VIM型测序结果对应GenBank中VIM-2亚型序列，为产VIM-2亚型金属酶的铜绿假单胞菌，与其对应序列AY560837.1比较，有100％同源性。
结论 儿科临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌对β-内酰胺类抗生素的耐药严重，有49.2％的菌株对碳青霉烯类抗生素耐药。碳青霉烯耐药菌株对青霉素类、头孢菌素类、β-内酰胺加酶抑制剂类抗生素的耐药性高于非耐药菌株，耐药现象严重。血液科病房分离出的多重耐药铜绿假单胞菌耐药现象比内科和ICU严重。
儿科临床分离对碳青霉烯类抗生素耐药的铜绿假单胞菌产金属酶率高，并以产IMP型金属酶为主，均为IMP-1亚型，少部分为产VIM型金属酶，均为VIM-2亚型。产金属酶是儿科铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要耐药机制。产金属酶菌株比非产金属酶菌株耐药严重，尤其对哌拉西林和哌拉西林/他唑巴坦。E试验法检测金属酶表型易用于铜绿假单胞菌产金属酶的初步筛选，不能单独作为检测铜绿假单胞菌产生金属酶的确证性试验。
监测儿科铜绿假单胞菌多重耐药特性及产金属酶的情况，对于指导临床治疗选药，有效控制耐药菌株的流行和传播都有十分重要的意义。