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脱落酸(ABA)是植物生长过程中很重要的调节激素之一。它对于植物生长发育中的多种生理过程及植物对于生物和非生物胁迫的响应都起到了重要的作用。当植物遭遇胁迫时,植物细胞积累的ABA可以调控很多相关基因的表达,以此来保护植物组织使其免受不良刺激的迫害。作为ABA信号通路中的重要元件,植物NADPH氧化酶是产生活性氧的主要场所。水稻CCaMK(OsDMI3)同样在ABA信号转导中扮演着重要的角色。实验室前期研究发现,水稻OsRbohs中OsRoohB和OssbohE受ABA诱导出现基因表达高峰。因此,本文主要对ABA信号通路中OsRbohB和OsRbohE与OsDMI3的关系进行了初步研究。主要研究结果如下:构建OsRbohB-YFP过表达载体并制备OsRbohB的dsRNA,分别转化水稻原生质体。运用荧光定量PCR方法,对OsDMI3的基因表达量进行检测。OssRboB基因过表达后OsDMI3的表达量上调,ABA处理后OsDMI3的上调量增加。OsRbohB基因沉默后OsDMI3的表达量下调,ABA处理后OsDMI3表达量略微增加。结果说明ABA诱导OsRbohB基因在转录水平上对OsDMI3基因起正调控作用。为了进一步探究OsRbohs与OsDMI3之间是否存在直接互作的关系,我们利用酵母双杂交技术、双分子荧光互补技术(BiFC)以及GST-pull down技术在体内外验证二者之间的相互作用。结果显示,OsRbohB-AD、OsRbohE-AD与OsDMI3-BD融合均能激活下游启动子使得菌落变蓝。证明OsRbohB和OsRbohE与OsDMI3存在相互作用。将OsrbohB基因的CDS编码区分别与YFPN和 YFPc相连,利用基因枪轰击洋葱上表皮细胞,培养后用激光共聚焦显微镜观察。结果显示,OsRbohB-YFPN与 OsDMI3-YFPc组合可以通过激光共聚焦观察到黄色荧光。OsDMI3-GST蛋白结合GST磁珠,加入体外翻译带有His标签OsRbohB蛋白。Western blot检测,用His单克隆抗体杂出一条100KD左右的条带。进一步通过体内外验证了 OsRbohB与OsDMI3存在相互作用的关系。利用水稻原生质体瞬时表达和瞬时沉默体系,对ABA诱导H202的产生中OsRbohB和OsRbohE所起的作用进行了探究。构建OsRbohB-mcherry和OsRbohE-mcherry载体分别转化水稻原生质体,ABA处理后发现原生质体内H202的积累量增加;而将OsRbohB和OsRbohE同时过表达并用ABA处理后,原生质体内的H202的积累量得到进一步增加。相反,利用基因瞬时沉默技术分别沉默OsRbohB基因和OsRbohE基因会使原生质体中H202的积累量减少。将两个基因同时沉默使原生质体中H2O2的含量大幅度减少,ABA处理后不能扭转这一现象。结果证明OsRbohB和OsRbohE基因都对ABA诱导下H202的产生有着很重要的影响。