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目的观察高继宁教授临床经验方“益肾方”对慢性肾衰竭(CRF)早期大鼠血清成纤维细胞生长因子23(FGF23)、肾组织Klotho mRNA和肾组织TGF-β1因子表达的影响,探讨其作用机制,扩大CRF早期用药选择。方法大鼠随机分成空白对照、模型对照、尿毒清阳性、益肾方低、中、高剂量,每组15只。除空白对照组外,其余各组采用腺嘌呤灌胃的方法建立CRF早期大鼠模型。在造模4周后,收集大鼠24h尿液,记录尿量,检测尿微量白蛋白(UmAlb)和24h尿蛋白定量(24hUTP);每组抽取2只,检测血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)等血生化指标,根据结果筛选。造模成功后益肾方低、中、高剂量组分别灌胃0.8 g/(kg·d)、1.6 g/(kg·d)、3.2 g/(kg·d)不同剂量益肾方,尿毒清阳性对照组灌胃1.6g/(kg·d)尿毒清颗粒,空白对照组和模型对照组灌胃等容积生理盐水,每天1次,连续8周。除空白对照组外,其余各组同时灌胃200 mg/kg腺嘌呤混悬液,隔日1次,空白对照组灌胃等量生理盐水,连续4周。给药期间,称体重、记录一般情况变化。给药结束后,检测血、尿生化指标,苏木素伊红染色(HE)和马松染色法(Masson)观察肾组织病理改变,分别用ELISA试剂盒、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和免疫印迹法(Western Blot)检测大鼠血清成纤维细胞生长因子FGF23、肾组织Klotho mRNA和肾组织TGF-β1因子的含量。结果1.一般情况:造模4周后,空白对照组大鼠状态良好,活动敏捷,体质量均匀增加,毛色光泽顺滑,二便正常。其余各组精神不振、活动迟缓,进食摄水减少,体质量下降,身体卷曲,毛发枯黄,大便变稀,尿量增加。给药8周后,与模型对照组相比,给药各组大鼠的精神、饮食、二便等情况均有好转,尤以益肾方的高剂量组恢复最为明显。2.尿生化指标的变化造模4周后,除空白对照组外,其余4组大鼠的24h尿量、UmAlb、24hUTP均与模型对照组无显著差别(P>0.05);给药8周后,模型对照组大鼠24h尿量、UmAlb、24hUTP均显著高于空白对照组,尿肌酐(UCr)显著低于空白对照组(P<0.01);益肾方低、中、高剂量组和尿毒清阳性对照组上述指标除UCr外均显著低于模型对照组(P<0.05),益肾方高剂量组上述指标更接近标准(P<0.01);尿N-乙酰-β-葡萄糖苷酶(NAG酶)、尿β2-微球蛋白(β2-MG)、尿α1-微球蛋白(α1-MG)各组均无显著差别(P>0.05)。3.血清生化指标的变化造模4周后,除空白对照组外,其余各组大鼠的SCr、BUN与模型对照组相比无显著差别(P>0.05);给药8周后,模型对照组大鼠血清胱抑素C(CysC)、BUN、SCr均明显高于空白对照组(P<0.01);益肾方低、中、高剂量和尿毒清阳性对照组上述指标均低于模型对照组(P<0.05),益肾方高剂量组上述指标更接近标准(P<0.01);各组血钙(Ca)、血磷(P)无明显差异(P>0.05)。4.肾组织病理学变化大体解剖可见:空白对照组大鼠肾脏大小、颜色及形态均正常,皮髓质界限明显。其余各组大鼠的肾脏体积增大、颜色变浅,以模型对照组大鼠外观变化最为显著,呈“大白肾”,且模型对照组部分大鼠出现肾组织包膜积水、充血现象,皮髓质分界模糊。各给药组大鼠肾脏颜色变红、体积变小,皮髓质界线尚清,基本趋于正常。HE染色:空白对照组大鼠肾小球、小管结构、形态均正常,无炎性细胞浸润,无纤维细胞增生。与空白对照组比较,模型对照组大鼠肾小球数量减少、质量下降,小管代偿性扩张,管内沉积大量的黄色嘌呤代谢产物,可见蛋白尿管型、纤维细胞和大量炎性细胞侵袭。与模型对照组比较,各给药组大鼠肾组织的病理改变明显减轻,以益肾方的高剂量组最为明显,病理改变减轻程度依次为高剂量组>中剂量组>尿毒清阳性对照组>低剂量组。Masson染色:空白对照组大鼠肾小球无明显变化,肾小管管腔无明显代谢物沉积,肾间质中仅有少量蓝色胶原纤维呈条索状沉积;与空白对照组比较,模型对照组大鼠肾小球球囊明显扩张,基底膜明显增厚,有大片蓝色胶原纤维沉积在肾小管间质及上皮;与模型对照组比较,给药各组大鼠上述纤维化程度均明显减轻,以益肾方高剂量组最为明显,纤维化减轻程度依次为高剂量组>中剂量组>尿毒清阳性对照组>低剂量组。5.血清FGF23表达量的变化模型对照组显著高于空白对照组(P<0.01);给药各组低于模型对照组(P<0.05),以益肾方高剂量组FGF23表达量明显下降(P<0.01)。6.肾组织Klotho mRNA表达量的变化模型对照组显著低于空白对照组(P<0.01);给药各组均高于模型对照组,以益肾方高剂量组Klotho mRNA表达量明显增加(P<0.05)。7.肾组织TGF-β1表达量的变化模型对照组显著高于空白对照组(P<0.01);益肾方的高剂量和尿毒清阳性对照组低于模型对照组(P<0.05);益肾方的低、中剂量组和模型对照组无显著差别(P>0.05)。结论1.益肾方能明显改善腺嘌呤致慢性肾衰竭早期大鼠一般情况、生化指标和病理变化,对慢性肾衰竭早期大鼠肾脏结构与功能均有明显的保护作用。2.腺嘌呤致慢性肾衰竭早期大鼠肾间质纤维化可能与肾组织Klotho mRNA的低表达、血清FGF23和肾组织TGF-β1因子的高表达密切相关,益肾方通过上调肾组织中Klotho mRNA的表达,下调血清FGF23和肾组织TGF-β1因子的表达,从而产生肾脏保护作用。