粘菌素是一种环状多肽类抗菌素,主要用于治疗畜禽胃肠道感染,在我国、欧洲等世界多个国家也长期作为促生长剂添加于饲料中。2016年,我国学者首次报道在大肠杆菌中发现质粒携带的粘菌素耐药基因(mcr-1),这种可水平传播的粘菌素耐药基因的报道突破了长期以来认为粘菌素不存在可转移耐药机制的观点。截至目前,世界范围内共发现八种粘菌素耐药基因(mcr-1,mcr-2,mcr-3,mcr-4,wcr-5,mcr-6,mcr-7,wcr-8)。作为治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的最后一道防线,这些粘菌素耐药基因和粘菌素耐药菌株的出现,极大地降低了粘菌素的使用有效性,同时也给人和动物的健康带来巨大的威胁。本研究首先建立了检测八个质粒介导的粘菌素耐药基因的荧光定量PCR(qPCR)方法,并使用该方法对来自我国9省市的1,552份猪拭子,24省市的3,343份家禽拭子以及134份人拭子样本进行了八种mcr基因的流行现状调查,同时还在我国禁止粘菌素用于促生长剂两年后,对mcr-1的持续性影响进行了评估,最后对来自食源性动物和非食源性动物来源的mcr-1阳性大肠杆菌进行了耐药特征分析,分子遗传比较以及大肠杆茵mcr-传播机制的研究。具体研究如下:1.检测八个粘菌素耐药基因(mcr-1-mcr-8)的荧光定量PCR方法的建立为了解我国质粒携带的粘菌素耐药基因的流行现状,本研究利用SYBR Green方法,结合高分辨率熔解曲线中的Tm值建立了检测八个mcr基因的荧光定量PCR(qPCR)方法。该方法具有高度的特异性,以合成的含有不同/mcr序列(wmcr-1-mcr-8)的质粒为阳性对照,能特异性的扩增出对应的mcr基因;同时,该方法具有极高的灵敏度,可在每个反应体系中检测出单个拷贝的目的基因。2.粘菌素耐药基因(mcr-1-mcr-8)在我国猪体内的分子流行病学调查近年来,由于食源性动物中抗菌药物的不合理使用而导致的细菌耐药现象越来越严重。而猪是我国重要的食源性动物之一,与我们的生活紧密相关。为了调查我国生猪养殖中粘菌素的耐药现状,本部分研究通过已建立的检测特异性mcr基因的qPCR方法,对来自我国9个省市的健康猪群(n=1,454只)的213份肛门拭子和1,339份鼻腔拭子进行了质粒介导的粘菌素耐药基因的流行现状调查。qPCR结果显示,在来自1,454只猪的拭子样品中,mcr-1的检出率最高,为79.2%,然后依次为mcr-6(58.9%)、mcr-2(56.3%)、mcr-4(42.7%)、wcr-5(32.9%)、mcr-3(18.7%)和 mcr-8(4.5%),mcr-7 的检出率最低,仅为 1.6%。比较不同的mcr基因在猪的鼻腔和肛门拭子中的阳性率,通过统计分析发现,在98个双拭子猪中,mcr-1,wcr-2,wcr-3,mcr-4和mcr-5的鼻腔拭子阳性率显著高于肛门拭子阳性率。携带mcr基因拭子的共感染统计分析发现,在猪的拭子样本中,最多可检测到7种mcr基因共感染样本。系统发育分析结果显示,我们得到了 31个新的wcr-2变体和2个新的mcr-3变体以及16个新的mcr-7变体。本研究证实了已知的八种质粒介导的粘菌素耐药基因(mcr-1-rmcr-8)均存在于我国的生猪中。3.粘菌素耐药基因(mcr-1-mcr-8)在我国家禽体内的分子流行病学调查除了家畜以外,家禽也是我国重要的食源性动物,为了解我国家禽中质粒介导的粘菌素耐药基因的流行现状,本部分检测了来自全国24省市活禽市场的1,696份禽泄殖腔拭子和1,647份禽咽喉拭子(n=1,836只)。qPCR结果显示,在3,343份禽拭子样品中,mcr-1的阳性率最高(27.25%,911/3,343),然后依次为mcr-(11.49%,384/3,343),mcr-5(5.59%,187/3,343),mcr-6(5.50%,184/3,343),mcr-3(3.83%,128/3,343),mcr-2(2.84%,95/3,343),mcr-8(0.24%,8/3,343)和mcr-7(0.03%,1/3,343)。比较 mcr 基因在相同家禽的咽喉和泄殖腔拭子样品中的阳性率,在1,507个双拭子家禽样本中,mcr-1,mcr-2,mcr-3和mcr-5在咽喉中的阳性率显著高于泄殖腔中的阳性率。mcr基因共感染统计分析发现,来自家禽口腔的拭子最多可检测到5种mcr(mcr-1,wcr-2,mcr-3,mcr-4和mcr-5)共感染的情况(鸡);泄殖腔拭子最多可检测到4种mcr(wcr-1,rwcr-3,wcr-4和mcr-5)共感染的情况(鹅)。系统进化树分析显示,我们得到了 5个新的mcr-2变体和5个新的mcr-3变体。本研究证实了已知的八种质粒介导的粘菌素耐药基因(mcr-1-mcr-8)均存在于我国的家禽中。4.粘菌素耐药基因(mcr-1-mcr-8)在不孕症患者阴道拭子中的分子流行病学调查根据以上研究,我们发现粘菌素耐药基因在我国的食源动物中普遍存在,同时食源动物与人之间又存在着密不可分的关系。而目前关于人样品中的mcr基因的流行病学数据多集中于对mcr-1的调查,对于其他粘菌素耐药基因在人类的流行状况,特别是在我国的流行状况还不清楚。本部分使用已建立的qPCR方法,检测了 134份女性阴道拭子核酸,qPCR结果显示,在所有被检样本中,共发现了 5种粘菌素耐药基因(mcr-1-mcr-5)。在134个检测样本中,检出mcr-4阳性样本17份(12.7%),mcr-2阳性样本2份(1.5%),mcr-3阳性样本2份(1.5%),wcr-1阳性样本和mcr-5阳性样本各1份(0.7%)。系统进化树分析发现,本研究所得到的人源样本的mcr-1,mcr-2,mcr-3,mcr-4和mcr-5的核苷酸序列与从同一地区得到的动物源样本的核苷酸序列完全一致。本研究提示,mcr基因有从动物传播给人的可能性,同时该研究也是首次在人源样本中检测到mcr-2,mcr-4和mcr-5。5.质粒介导的粘菌素耐药基因(mcr-1)的持续性影响基于mcr-1广泛而快速的传播现状和对畜禽养殖业及人类用药安全造成的重大影响,我国农业部已于2017年4月1日起全面禁止使用硫酸粘菌素作为促生长剂。2019年3月,我们对江苏和浙江的部分猪场的mcr-1的流行情况进行了再次调查,方差分析结果显示,2019年采集的肛门拭子中mcr-1阳性率与2016年采集的肛门拭子中mcr-1的阳性率相比没有显著差异。此外我们将含不同gyrA基因序列的mcr-1阳性菌株和mcr-1阴性菌株以1:99的比例混合后进行粘菌素转移的体外模拟实验。结果显示,在没有粘菌素的情况下,耐药基因在细菌繁殖60代内依然以一定的比例存在,表明即使没有粘菌素的选择压力,mcr-也会发生转移。本研究提示,mcr-1在禁用后仍广泛存在,粘菌素耐药基因在畜牧业中的防控形势依然严峻。6.携带mcr-1基因的大肠杆菌分离株的耐药特性研究近年来,抗菌药物常被作为饲料添加剂或临床治疗药物使用于动物之中,导致动物源大肠杆菌的耐药性问题尤其是多重耐药现象越来越严重。为了解mcr-1阳性大肠杆菌的耐药特性,本部分使用临床分离的13株食源动物大肠杆菌和15株非食源动物来源大肠杆菌,采用微量肉汤稀释法测定了 28株大肠杆菌对粘菌素的药物敏感性。最小抑菌浓度(MIC)结果显示,28株大肠杆菌均表现出较低程度的粘菌素耐受性(4-8μg/m1)。采用Kirby-Bauer纸片扩散法测定了所有菌株对其它16种代表性药物的体外敏感性,结果显示在携带mcr-1基因的28株食源动物大肠杆菌中,耐药率最高的5种药物分别为氨苄西林(96.40%,27/28)、头孢噻肟(82.1%,23/28)、头孢曲松(82.1%,23/28)、甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲基异恶唑(78.6%,22/28)和氯霉素(67.9%,19/28);而敏感性最高的4种药物分别为阿莫西林/克拉维酸(]00%,28/28)、厄他培南(100%,28/28)、阿米卡星(100%,28/28)和呋喃妥英(100%,28/28)。比较不同来源的大肠杆菌的耐药差异,发现分离于食源动物的大肠杆菌对链霉素、萘啶酸的耐药率明显高于非食源动物大肠杆菌分离株,且所有对环丙沙星耐药的菌株都来自于食源动物分离株。对所有28株携带mcr-1基因的大肠杆菌耐药谱进行统计,显示28个菌株共有23种耐药谱型。对3种及其以上携带mcr-1基因的多重耐药菌株进行统计,结果表明,携带mcr-1基因的食源动物和非食源动物大肠杆菌的多重耐药率分别为100%和93.3%。mcr-1阳性食源动物大肠杆菌分离株最高耐11种抗菌药物,mcr-1阳性非食源动物大肠杆菌分离株最高耐9种抗菌药物。本研究进一步明确了来自江苏省的wcr-1阳性的食源性动物和非食源性动物分离株的耐药特征,为控制mcr-1阳性大肠杆菌耐药性的进一步发展和临床用药选择提供依据。7.大肠杆菌mcr-1传播机制的研究为了进一步研究大肠杆菌mcr-1的传播机制,本部分首先使用多位点序列分型方法(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法分析了来自食源动物和非食源动物中的28株mcr-1阳性大肠杆菌的分子遗传特点。MLST分型结果显示28个菌株可分为17个ST型。PFGE分型结果显示在获得图谱的26株大肠杆菌中,多数菌株的同源性在70%至90%之间。同时在食源动物和非食源动物中,都存在相似度为100%的菌株,表明他们有同一地区单克隆传播的可能性。对携带mcr-1的28株大肠杆菌进行质粒转移接合实验,结果显示共有19株大肠杆菌接合成功,接合率为67.9%。对所有接合成功的菌株进行粘菌素的最小抑菌浓度(MIC)测定,发现所有接合子的MIC值与供体菌J53菌株相比均提高了 2-4倍,说明粘菌素耐药性通过质粒发生了转移。对所有28株mcr-1阳性的大肠杆菌进行质粒脉冲场凝胶电泳(S1-PFGE)分析,结果显示26株mcr-1 阳性大肠杆菌含有1-4个质粒,且多数菌株含有一个约60kb大小的质粒。对质粒转移接合成功的19个接合子进行12种代表性药物的体外敏感性实验,结果显示耐药性在16个接合子中发生了部分或全部转移,表明携带mcr-1基因的质粒可能同时携带其他耐药基因,通过基因水平转移的方式在不同的菌株之间传播。本研究进一步分析了来自食源动物和非食源动物中mcr-1 阳性大肠杆菌的分子遗传特点和wcr-1在大肠杆菌中的分子传播机制。综上所述,本研究成功建立了检测特异性mcr的qPCR方法,并应用该方法调查了我国食源性动物(猪和家禽)和人体内的mcr流行情况,发现mcr基因在我国的猪和家禽体内普遍存在,同时首次在人样本中检测出mcr-2,mcr-4和mcr-5;本研究还进一步调查了禁止粘菌素作为促生长剂使用两年后mcr-1的持续性影响,发现禁止粘菌素使用后,mcr-1在动物体内仍广泛存在;此外本研究还对分离于食源性动物和非食源性动物的mcr-1阳性大肠杆菌分离株进行了耐药特征分析,分子遗传特点比较和传播机制研究,发现mcr-1既可以通过单克隆传播,也可以通过质粒介导的方式水平传播。本研究揭示了我国mcr基因在食源动物中的分布情况,为兽医中粘菌素耐药菌株的临床用药提供依据,也为有效监测和控制粘菌素耐药基因在动物中的传播及流行提供依据。